[发明专利]利用PCR-RFLP检测绵羊DAZL基因单核苷酸多态性的方法及其应用

权利要求书

1.利用PCR-RFLP检测湖羊DAZL基因单核苷酸多态性的方法在湖羊分子育种中的应用，其特征在于，所述方法包括利用PCR-RFLP检测湖羊DAZL基因第26750位为G或A的单核苷酸多态性；所述应用为建立基因型为GG纯合型的湖羊群体，提高湖羊产羔率。

2.根据权利要求1所述的利用PCR-RFLP检测湖羊DAZL基因单核苷酸多态性的方法在湖羊分子育种中的应用，其特征在于，

所述的检测方法包括以下步骤：

S1采集屠宰湖羊的睾丸组织，经过液氮环境保存后，再经过研磨成粉，将得到的粉末取0.1g置于1000 μL DNA抽提缓冲液，并经过在55℃下的蛋白酶K处理，取反应后溶液经过Tris-饱和酚处理得到DNA提取液；

S2将所述的DNA提取液经过琼脂糖凝胶电泳检测，选择电泳结果中条带均一、无拖尾和无降解的DNA提取液，稀释至50 ng/μL；

S3采用混合加样法以特异性引物对P进行PCR扩增，得到多个DNA样品片段，将所述的多个DNA样品片段采用限制性内切酶AluI消化后，进行琼脂糖凝胶电泳，将得到的多个DNA样品小分子进行切胶回收及纯化，得到纯化DNA；所述的特异性引物对P为：

上游引物：5’- AGTTTGGAGTCTCAGGATTT -3’ 20nt，

下游引物：5’- GCATGATGTACTCTGTGTAG -3’ 20nt；

S4针对所述纯化DNA进行凝胶成像，判定其基因型，确定纯化DNA的基因型；将所述纯化DNA进行双向测序，判定绵羊DAZL基因第26750位的单核苷酸多态性。

3.根据权利要求2所述的利用PCR-RFLP检测湖羊DAZL基因单核苷酸多态性的方法在湖羊分子育种中的应用，其特征在于，

所述S2中稀释步骤前将选取的DNA提取液通过吸光度检测判定是否需要纯化处理。

4.根据权利要求3所述的利用PCR-RFLP检测湖羊DAZL基因单核苷酸多态性的方法在湖羊分子育种中的应用，其特征在于：所述的通过吸光度检测判定为：测定DNA提取液在260nm、280nm的紫外光下的OD值，计算DNA含量和OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值；当OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值小于1.6时，进行纯化处理；当OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值大于1.8时，进行去除RNA的纯化。

5.根据权利要求2所述的利用PCR-RFLP检测湖羊DAZL基因单核苷酸多态性的方法在湖羊分子育种中的应用，其特征在于：计算DNA含量公式为：

DNA浓度ng/μL=50×OD₂₆₀值×稀释倍数。

6.根据权利要求2所述利用PCR-RFLP检测湖羊DAZL基因单核苷酸多态性的方法在湖羊分子育种中的应用，其特征在于：所述的PCR扩增为：94℃预变性5min；94℃变性30 s，57℃退火30s，72℃延伸30s，34个循环；72℃延伸5 min。

7.根据权利要求2所述的利用PCR-RFLP检测湖羊DAZL基因单核苷酸多态性的方法在湖羊分子育种中的应用，其特征在于：所述的混合加样法为：根据每一个PCR反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的所述PCR反应体系的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5 mL或者2.0 mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2 mLEppendorf PCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增。

8.根据权利要求7所述的利用PCR-RFLP检测湖羊DAZL基因单核苷酸多态性的方法在湖羊分子育种中的应用，其特征在于：所述的PCR反应体系为：2.5μL的1×buffer缓冲液、0.5μL的10pmol/L的特异性引物对P、5.0μL的浓度为50ng/μL的品种DNA池和17.0μL的灭菌超纯水。