[发明专利]一种从临床血液中检测铜绿假单胞杆菌病原菌的方法

说明书

本发明提供了一种从临床血液中检测铜绿假单胞杆菌病原菌的方法，包括以下步骤：(1)血液中铜绿假单胞杆菌基因组DNA的提取；(2)PCR检测：a、利用铜绿假单胞杆菌基因组DNA序列设计特异性的PCR引物，PCR引物包括正向引物和反向引物；正向引物如SEQ ID NO.1所示；反向引物如SEQ ID NO.2所示；引物的扩增片段长度为187bp；b、以从血液中提取的铜绿假单胞杆菌基因组DNA为模板，采用PCR引物进行PCR扩增；c、对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳及检测，扩增出长度为187bp的片段则判定为检测出铜绿假单胞杆菌。本发明方法快速高效，特异性和灵敏度高，对血液中铜绿假单胞杆菌的检测极限达到10CFU/mL，在临床上具有十分广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及血液感染病原菌的检测技术领域，具体涉及一种从临床血液中检测铜绿假单胞杆菌病原菌的方法。

背景技术

铜绿假单胞杆菌(PA)是临床常见的条件致病菌之一，是医院感染的重要致病菌。铜绿假单胞杆菌引起的血流感染病情严重且死亡率高，给临床诊断和治疗提出巨大挑战。临床上对于铜绿假单胞杆菌导致的血流感染，需经过血培养分离菌株、镜检或血清学等生理生化分析方法。这种传统的临床检验方法检测周期长，检测过程繁琐，而且检测的特异性和敏感性低，无法及时有效地对临床样本出具检测结果报告。传统临床检测方法的这些局限性也直接导致临床铜绿假单胞杆菌感染病患在早期感染诊断和医师指导用药方面错过最佳的前期干预和早期治疗时间，从而可能使患者病情加重以及死亡率升高。所以，开发一种高效率检测血液中铜绿假单胞杆菌感染在医院检验中具有重大地临床意义。

发明内容

本发明提供了一种快速、简单和高效的从临床血液中检测铜绿假单胞杆菌病原菌的方法，通过对铜绿假单胞杆菌感染病患血液中铜绿假单胞杆菌基因组DNA的有效提取并进行特异的PCR反应实验，可以迅速高效地检测出血液中铜绿假单胞杆菌感染。该发明的方法快速高效，不仅可以将检测时限缩短至3-6小时，而且特异性和灵敏度高。这种简单方便的发明方法在临床上具有十分广阔的应用前景。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

一种从临床血液中检测铜绿假单胞杆菌病原菌的方法，包括以下步骤：

(1)血液中铜绿假单胞杆菌基因组DNA的提取；

(2)血液中铜绿假单胞杆菌PCR检测：

a、利用铜绿假单胞杆菌基因组DNA序列设计一段特异性的PCR引物，所述PCR引物包括正向引物和反向引物；所述正向引物如SEQ ID NO.1所示：5’-GAGCTGCCGTACCAGTTGAA-3’；所述反向引物如SEQ ID NO.2所示：5’-GGGTCTGGGCATAGAGGTTG-3’；

引物的扩增片段长度为187bp；

b、以步骤(1)中从血液中提取的铜绿假单胞杆菌基因组DNA为模板，采用特异性的PCR引物进行PCR扩增；

c、对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳及检测，扩增出长度为187bp的片段则判定为检测出铜绿假单胞杆菌。

优选地，步骤(2)的步骤(b)中，PCR扩增时PCR的反应体系为：2倍Flash Hot StartMaster Mix 5μL，2μmol/L的正向引物1μL，2μmol/L的反向引物1μL，基因组DNA模板1μL，双蒸水补足至10μL。

PCR的反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性5s，55℃退火10s，72℃延伸5s，30次循环；最后72℃延伸7min，16℃保存。

优选地，步骤(2)中，提供铜绿假单胞杆菌基因组DNA提取的菌含量≥10CFU/mL。

优选地，步骤(1)中，血液样品中铜绿假单胞杆菌基因组DNA的提取具体包括以下步骤：