[发明专利]一种钙营养需求相关基因突变位点的检测方法

说明书

本发明公开了一种钙营养需求相关基因突变位点的检测方法，属于通过设计的目标位点特异性引物的单管多重PCR扩增反应得到目标片段，目标片段经过限制性内切酶消化，然后再利用单碱基延伸技术对经过限制性内切酶消化的目标片段进行双向延伸，得到待检基因位点，最后通过核酸质谱分析精确测定目标DNA序列；其中，所述单碱基延伸技术是采用单碱基延伸引物组对所述目标片段进行双向延伸；与传统的SNP位点检测技术相比，可以在一个反应中实现多个SNP位点的检测，具有较高的应用价值；降低检测工作量以及提高检测效率。

技术领域

本发明属于涉及生物医学技术领域，具体涉及一种钙营养需求相关基因突变位点的检测方法。

背景技术

钙是生物必需的元素。对人体而言，无论肌肉、神经、体液和骨骼中，都有用Ca²⁺结合的蛋白质。钙是人类骨、齿的主要无机成分，也是神经传递、肌肉收缩、血液凝结、激素释放和乳汁分泌等所必需的元素。钙约占人体质量的 1.4％，参与新陈代谢，每天必须补充钙；人体中钙含量不足或过剩都会影响生长发育和健康。研究发现VDR基因与CASR基因变异，会影响钙的吸收；而关于VDR基因与CASR基因的检测，传统的SNP位点检测技术，一次只能检测其中的一种基因，导致检测工作量大。

发明内容

为了解决传统的SNP位点检测技术存在的一次只能检测其中的一种基因，导致检测工作量大的问题，本发明提供了一种钙营养需求相关基因突变位点的检测方法。

本发明所采用的技术方案为：一种钙营养需求相关基因突变位点的检测方法，通过设计的目标位点特异性引物的单管多重PCR扩增反应得到目标片段，目标片段经过限制性内切酶消化，然后再利用单碱基延伸技术对经过限制性内切酶消化的目标片段进行双向延伸，得到待检基因位点，最后通过核酸质谱分析精确测定目标DNA序列；

其中，所述单碱基延伸技术是采用单碱基延伸引物组对所述目标片段进行双向延伸。

在其中一个实施例中，所述目标位点特异性引物包括：

用于扩增钙营养需求相关基因VDR-RS1544410片段的第一特异性引物，第一特异性引物的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID Nos：1所示且反向引物的核苷酸序列如SEQ IDNos：2所示；SEQ ID Nos：1为：acgttggatggaggaactaga taagcaggg；SEQ ID Nos：2为acgttggatgagagcagagcctgagtattg

用于扩增钙营养需求相关基因CASR-RS1042636片段的第二特异性引物，第二特异性引物的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID Nos：3所示且反向引物的核苷酸序列如SEQ IDNos：4所示；SEQ ID Nos：3为：acgttggatgtcagcgtatc gctgcttttc；SEQ ID Nos：4为：acgttggatgtgatgagcctcagaagaacg。

在其中一个实施例中，所述单碱基延伸技术所用的单碱基延伸引物组包括：

用于扩增钙营养需求相关基因VDR-RS1544410片段的第一单碱基延伸引物，核苷酸序列如SEQ ID Nos：5所示；SEQ ID Nos：5为：aagagcagagcctg agtattgggaatg；

用于扩增钙营养需求相关基因CASR-RS1042636片段的第二单碱基延伸引物，核苷酸序列如SEQ ID Nos：6所示；SEQ ID Nos：6为cttctttctggtgcgtag aattcc。

在其中一个实施例中，在第一单碱基延伸引物的5`端和第二单碱基延伸引物的5`端均加入10个核苷酸，10个核苷酸的固定序列为ACGTTGGATG。

在其中一个实施例中，所述单管多重PCR扩增的反应程序为：95℃2分钟， 95℃30秒，56℃20秒，72℃60秒，45循环，72℃5分钟，4℃保温。