[发明专利]一种棘胸蛙蝌蚪变态期死亡风险预测技术

说明书

一种棘胸蛙蝌蚪变态期死亡风险评估技术，是利用高通量测序技术通过分析原核生物16S rRNA基因V4‑V5高变区扩增子解析棘胸蛙蝌蚪变态前期和变态期肠道菌群结构，通过对特定的菌种和菌属在菌群结构中的相对比例计算预测棘胸蛙蝌蚪在变态期的死亡风险因子，为预测和防范棘胸蛙蝌蚪变态期死亡风险提供技术手段。

技术领域

本发明涉及农业水产养殖领域，具体涉及一种棘胸蛙蝌蚪变态期死亡风险预测技术。

背景技术

棘胸蛙因其肉质鲜美、营养丰富且具有药用价值而广受市场青睐，也使得棘胸蛙养殖具有广阔的市场前景。但由于棘胸蛙养殖过程中疾病频发，尤其是在棘胸蛙蝌蚪变态期，是棘胸蛙养殖过程中死亡率最高的时期，死亡率甚至超过50%，对棘胸蛙养殖产业造成了较大损失，成为阻碍棘胸蛙养殖业发展的重要瓶颈。

脊椎动物肠道中生存着大量微生物，它们共同构成脊椎动物的肠道菌群，通过与宿主免疫系统相互作用形成特定的菌群结构并在宿主营养、生长、免疫、发育、健康等方面都发挥重要作用。两栖动物在蝌蚪变态期会出现肠道菌群的重构过程，其肠道菌群会出现重大的改变，并对两栖动物蝌蚪的生长、发育和免疫产生特定的影响。并且大量研究证实宿主的健康状况与肠道菌群结构之间存在密切的相关关系。因此，可以通过两栖动物蝌蚪的肠道菌群结构推断两栖动物蝌蚪的健康状况。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种棘胸蛙蝌蚪变态期死亡风险预测技术，利用该技术能够通过抽样分析棘胸蛙变态前期蝌蚪肠道菌群结构，预测棘胸蛙蝌蚪变态期的死亡率，为预测和防范棘胸蛙蝌蚪变态期死亡风险提供技术手段。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种棘胸蛙蝌蚪变态期死亡风险预测技术，该技术的步骤（图1）如下：

（1）从待进行风险预测的养殖池塘中随机抽取6尾棘胸蛙变态前期蝌蚪，用70%的酒精溶液擦净其表皮粘液后，采用200g/L MS-222麻醉剂进行麻醉后在无菌条件下解剖取其肠道，放于2 ml离心管中。

（2）利用细菌DNA提取试剂盒按照试剂盒说明书提取肠道菌群总DNA。

（3）采用原核生物通用引物515F（5′端含有12 nt样品特异性barcode序列）和909R对原核生物16S rRNA基因V4-V5高变区进行PCR扩增。每50 μl扩增反应体系包含1 × PCR缓冲液、0.5 U Taq DNA聚合酶、0.4 mM dNTP、各2.0 μM 引物和20 ng肠道菌群总DNA模板。PCR反应条件为94℃预变性10分钟，30个循环的常规PCR（94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒），最后72℃延伸10分钟。PCR产物经DNA凝胶回收试剂盒纯化后，按照其DNA片段含量等摩尔分子量混合。

（4）混合后的DNA片段采用Illumina MiSeq测序仪进行测序。

（5）测序得到的原始reads序列经FLASH 1.2.8软件进行拼接后采用QIIME 1.9.0软件根据样品特异性barcode序列将序列分选到不同的样品中，并去除低质量序列。而后用Uchime软件检测嵌合体序列并去除后，采用UPASE软件按照序列相似性>97%为同一个OTU的划分标准进行OTU划分，采用RDP classifier算法参照Greengenes 13.8数据库对各OTU进行物种注释，并根据各样品测序深度选择测序深度最低的样品测序得到的高质量序列数进行随机重抽样，以排除测序深度对后续分析的影响。