[发明专利]一种线粒体靶向次氯酸比率型双光子荧光探针及其制备方法和用途

说明书

本发明公开了一种线粒体靶向次氯酸比率型双光子荧光探针及其制备方法和用途，其中线粒体靶向次氯酸比率型双光子荧光探针，是以以咔唑为母体，其结构式如下：本发明荧光探针应用于水溶液中HClO检测时，选择性高，响应速度快，探针荧光比率(I_525nm/I_465nm)与HClO的浓度之间有很好的线性关系，检测限低至35nM。此外，该荧光探针分子还具有优良的双光子吸收性能。细胞毒性测试表明该探针对于细胞几乎没有什么毒副作用。双光子共聚焦荧光显微成像实验表明该探针具有很好的线粒体定位能力和细胞透膜性，适用于细胞线粒体内HClO的双光子荧光成像和定量检测。

技术领域

本发明涉及一种线粒体靶向次氯酸比率型双光子荧光探针及其制备方法和用途，以实现双光子成像定量检测细胞线粒体内的HClO，具有双光子吸收性能优良，细胞毒性低，透膜性和生物相容性好，选择性和光稳定性高等优点。

背景技术

近来，活性氧物质由于其与体内多种生物过程的关联而引起了医学研究人员越来越多的关注。作为高活性氧物种，内源性HClO主要是通过体内髓过氧化物酶(MPO)催化的过氧化氢和氯离子之间的反应产生。内源性HClO由于其强氧化能力而成为生物体内的一把双刃剑。正常生理水平的HClO可有效抑制体内微生物和病原体并调节细胞凋亡。然而，过量HClO的产生则导致细胞和组织损伤，并可能与某些疾病如炎症性疾病或癌症有关。在体液中，次氯酸和次氯酸根阴离子在微摩尔浓度的水平上处于平衡，当身体处于疾病状态时，其可能增加至毫摩尔浓度。因此，体内HClO水平的实时监测对于健康科学的研究具有重要意义。

线粒体不仅为人体生命活动提供能量，还参与多种复杂的生理过程。它的异常与癌症、糖尿病、阿尔兹海默病等疾病相关。作为细胞内氧的主要消费者，线粒体是细胞内活性氧物种(ROS)的主要来源。HClO作为细胞内活性氧的一种，在线粒体中维持适当的浓度对保证细胞内多种功能的正常是十分重要的。因此在亚细胞水平，尤其是在线粒体中监测次氯酸是特别有意义和价值的。靶向线粒体类荧光探针主要是基于线粒体带有负的膜电位，进而利用本身带有正电荷的荧光团或者在荧光团中引入三苯基膦或季铵盐等带正电荷的基团来定位线粒体。

荧光探针法因其具有选择性高，灵敏度高，实时监测等优点而被经常用作有效的生物分析工具。以单一荧光强度作为响应信号的荧光探针对环境因素和仪器参数较为敏感，采用两种荧光强度比的比率型探针因具有内部校正能力而更加适合于定量分析。目前，许多可用于体内HClO成像的比率型荧光探针已被成功开发出来，但其中大多数是在单光子激发下实现体内成像的。对于生物成像而言，短波长激发会导致样品的光损伤，浅穿透和来自内在生物分子的自发荧光等问题，而双光子成像的应用则极大地弥补了这些缺陷。因而双光子荧光探针已经作为科研工作者研究的一个重要课题。

咔唑类化合物因具有较强的给电子能力、大的共轭体系、良好的刚性平面、稳定的光学性能以及易于化学修饰引入官能团而被经常应用为荧光探针的母体。作为一种经典的荧光团，以咔唑为母体的单光子荧光探针已经被很多文献所报道，但以其设计的双光子荧光探针则相对少见。

发明内容

本发明旨在提供一种线粒体靶向次氯酸比率型双光子荧光探针及其制备方法和用途，所要解决的技术问题是通过分子设计得到一种合适的荧光探针结构，具有双光子吸收性能优良，细胞毒性低，透膜性和生物相容性好，选择性和光稳定性高等优点，以实现水溶液和细胞线粒体内HClO的定量检测和在线粒体中的双光子荧光成像。

本发明线粒体靶向次氯酸比率型双光子荧光探针，是以以咔唑为母体，简记为MCL，其结构式如下：

本发明线粒体靶向次氯酸比率型双光子荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：化合物1的合成