[发明专利]一种采用HPLC-HG-AFS法测定全血或红细胞中四种砷形态浓度的方法

权利要求书

1.一种采用HPLC-HG-AFS法测定全血或红细胞中四种砷形态浓度的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、配制四种砷形态的标准溶液：

分别配制一定浓度的As^III、MMA^V、DMA^V和As^V四种砷形态的储备液；将各储备液在2～50ng/mL范围内逐级稀释得到不同浓度的四种砷形态的标准溶液；

步骤二、确定HPLC-HG-AFS检测条件：

高效液相条件：阴离子交换色谱柱：Hamilton PRP-X100，150mm×4.1mm，5μm；流速：1.0mL/min；流动相：13mmol/L无水乙酸钠，3mmol/L无水磷酸二氢钠，4mmol/L硝酸钾和0.2mmol/L乙二胺四乙酸二钠组成的混合溶液；

原子荧光光谱条件：原子化器高度：8.0mm；主电流：80mA；辅电流：40mA；屏蔽气流量：900mL/min；载气流量：300mL/min；负高压：300V；泵速：65r/min；还原液：含有质量浓度为3％的KBH₄和质量浓度为0.5％的KOH；载流液：体积浓度为10％的HCl；

步骤三、绘制四种砷形态的标准曲线：

在步骤二确定的HPLC-HG-AFS色谱条件下依次将步骤一配制的四种砷形态的标准溶液进样分析，以砷形态的浓度x为横坐标，砷形态峰面积y为纵坐标，进行线性回归，分别绘制四种砷形态的标准曲线方程；

步骤四、处理待测样本：

(1)收集全血样本：收集血液样本于EDTA抗凝管中；

(2)收集红细胞样本：收集的全血样本于4℃条件下离心去除上层血浆，剩余部分加生理盐水稀释，再加入等体积淋巴细胞分离液得到中间样本，将中间样本置于4℃条件下离心，所得样本分为四层，提取最底层，得到红细胞样本；

(3)按一定体积比将全血样本或红细胞样本、质量浓度为5％的氨水和步骤二所述流动相充分混匀得到处理液，按一定体积比向所述处理液中加入质量浓度为30％的双氧水，涡旋混匀，得到预处理样本，所得预处理样本室温下静置过夜；

(4)检测前，将过夜的预处理样本于4℃下2000rpm离心10min，取上清液，按一定体积比与质量浓度为20％的高氯酸混匀并置于4℃条件下高速离心，取上清液过0.22μm滤膜得到检测样本；

步骤五、样本的检测与数据处理：

将步骤四所得检测样本按照步骤二确定的HPLC-HG-AFS检测条件进行检测，由保留时间定性，峰面积定量，利用相应砷形态的标准曲线，外标法定量，计算得出血液样本中各砷形态的浓度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一所述四种砷形态的储备液浓度均为1000ng/mL，所述四种砷形态的标准溶液中砷形态的浓度均依次为50、30、25、10、5和2ng/mL。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤二所述高效液相的进样体积为100μL。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤三所述四种砷形态的标准曲线方程分别为：

As^III：Y＝1.178×10⁵+2.184×10⁵X，r²＝0.9996，线性范围为2.00～50ng/mL；

DMA^V：Y＝3.714×10³+1.778×10⁵X，r²＝0.9986，线性范围为2.00～50ng/mL；

MMA^V：Y＝4.527×10⁴+2.287×10⁵X，r²＝0.9969，线性范围为2.00～50ng/mL；

As^V：Y＝1.259×10⁵+1.822×10⁵X，r²＝0.9986，线性范围为2.00～50ng/mL。