[发明专利]一种快速检测爪哇根结线虫的LAMP引物及其应用、检测方法

权利要求书

1.引物组合，其特征在于，包括正向外引物、反向外引物、正向内引物和反向内引物；

所述正向外引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述反向外引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

所述正向内引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

所述反向内引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

2.如权利要求1所述的引物组合在检测爪哇根结线虫中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，待测样品为线虫样品、植物根组织样品和/或土壤样品。

4.如权利要求1所述的引物组合在制备爪哇根结线虫检测试剂或试剂盒中的应用。

5.一种爪哇根结线虫的LAMP检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、提取待测样品的DNA；

步骤2、以所述待测样品的DNA为模板，利用如权利要求1所述的引物组合，建立LAMP反应体系，进行LAMP扩增；

步骤3、根据步骤2中LAMP扩增的反应结果判定所述待测样品中是否含有爪哇根结线虫；

所述判定标准为：

(1)向所述LAMP扩增的产物中加入显色剂，如果所述LAMP扩增的产物呈绿色，则检测结果为阳性，表明所述待测样品中含有爪哇根结线虫；如果所述LAMP扩增的产物呈橙色，则检测结果为阴性，表明所述待测样品中不含有爪哇根结线虫；或

(2)取所述LAMP扩增的产物于2％琼脂糖凝胶中电泳，在紫外光下进行检测，如果出现梯状条带，表明所述待测样品中含有爪哇根结线虫；如果未出现梯状条带，表明所述待测样品中不含有爪哇根结线虫。

6.如权利要求5所述的LAMP检测方法，其特征在于，所述LAMP反应体系为25μL，包括1μLDNA模板，0.2μmol/L正向外引物，0.2μmol/L反向外引物，1.6μmol/L正向内引物，1.6μmol/L反向内引物，1.2mmol/LdNTPs，6mmol/L MgSO₄，20mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)，10mmol/LKCl，10mmol/L(NH₄)₂SO₄，0.1％Triton X-100，8U Bst DNA聚合酶，余量用ddH₂O补足。

7.如权利要求5或6所述的LAMP检测方法，其特征在于，所述显色剂包括体积比为1:9的SYBR green I与PCR级DMSO的混合物。

8.如权利要求5至7任一项所述的LAMP检测方法，其特征在于，所述显色剂的加入时机为：步骤2中所述建立LAMP反应体系之后、LAMP扩增之前，在PCR管内盖上加入1μL显色剂。

9.如权利要求5至8任一项所述的LAMP检测方法，其特征在于，所述LAMP扩增的反应条件为：60℃～65℃保温30～90min。

10.一种快速检测爪哇根结线虫的LAMP试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物组合。