[发明专利]单细胞测序的建库方法在审
| 申请号： | 201910868822.4 | 申请日： | 2019-09-16 |
| 公开（公告）号： | CN110438572A | 公开（公告）日： | 2019-11-12 |
| 发明（设计）人： | 孔培涛;李奇;陈亚庆;杨圳;蔡建飞 | 申请（专利权）人： | 上海其明信息技术有限公司 |
| 主分类号： | C40B50/06 | 分类号： | C40B50/06;C12Q1/6869 |
| 代理公司： | 北京金信知识产权代理有限公司 11225 | 代理人： | 李雪芹;徐琳 |
| 地址： | 201210 上海市浦东新*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 建库 固定的 细胞 测序 细胞核 反转录引物 连接反应 模板转换 实验材料 样品来源 引物标记 条形码 对甲醛 反转录 生成子 有效地 富集 裂解 引物 文库 新鲜 | ||
1.单细胞测序的建库方法，其包括以下步骤：
(a)对甲醛固定的细胞利用第一反转录引物进行细胞内反转录标记第一轮条形码(barcode)；
(b)利用连接反应，使用第二轮引物和第三轮引物标记第二轮和第三轮barcode；
(c)裂解生成子文库，模板转换后，利用PCR富集模板；
(d)利用index PCR标记第四轮barcode。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)中的所述细胞为多个细胞，所述多个细胞包括不同种类的细胞或不同组织来源的细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)中，所述第一反转录引物按5’至3’依次包括5’引物合成磷酸化标记，用于和第二轮连接的linker序列的固定结构，用于区分细胞来源的作为barcode序列的可变结构，以及用于和mRNA的poly(A)尾进行特异性结合以保证反转录的特异性的固定结构。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述第一反转录引物包括SEQ ID NO:1-96。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(b)中，所述第二轮引物按5’至3’依次包括5’引物合成磷酸化标记，用于和第三轮连接的linker序列的固定结构，用于区分细胞来源的作为barcode序列的可变结构，以及用于和第一轮连接的linker序列的固定结构。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述第二轮引物包括SEQ ID NO:97-192。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(b)中，所述第三轮引物按5’至3’依次包括5’引物合成磷酸化标记，用于index PCR反应的同时加上第四轮的固定结构，用于标记细胞内分子的固定结构，用于标记细胞的作为barcode序列的可变结构，以及用于和第二轮连接的linker序列的固定结构。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述第三轮引物包括SEQ ID NO:193-288。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(d)中，一个P5分别与P7-1～P7-8组成为一对引物，适配Illumina测序平台测序，对构建好的文库进行测序。
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