[发明专利]RNA文库的制备方法、测序方法和试剂盒

权利要求书

1.一种制备RNA文库的方法，其特征在于，包括如下步骤：

以RNA为模板，反转录生成第一链cDNA，获得RNA/cDNA杂合体；

在RNA/cDNA杂合体的至少一个末端添加第一预设序列形成RNA/DNA杂合体，所述RNA/DNA杂合体为RNA文库；

所述第一预设序列位于cDNA链的至少一个末端。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，于第一反应体系中进行所述反转录，所述第一反应体系包含反转录酶和引物，所述反转录酶不具有RNA降解功能；

任选的，所述反转录酶选自M-MμLV酶和其工程酶中的至少一种；

任选的，所述引物为随机引物；

任选的，所述引物的5’端为第二预设序列；

任选的，所述引物的5’端的核苷酸为封闭核苷酸。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，添加第一预设序列反应与反转录反应在第一反应体系中同步进行；

任选的，所述第一预设序列位于所述cDNA链的5'端；

任选的，所述第一预设序列位于所述cDNA链的3'端；

任选的，通过连接反应或聚合反应在所述cDNA链的至少一个末端添加第一预设序列。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，通过连接反应使所述cDNA链的至少一个末端具有第一预设序列，所述第一反应体系包含连接酶；

任选的，所述第一反应体系包括接头，所述接头为双链DNA，连接所述接头与所述RNA-DNA杂合体以获得cDNA链的至少一个末端具有第一预设序列的RNA-DNA杂合体；

任选的，所述接头为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，通过聚合反应使所述cDNA链的至少一个末端具有第一预设序列；

任选的，所述聚合反应所使用的酶与反转录反应使用的酶相同；

任选的，所述cDNA链的3’为单链末端，所述第一反应体系包括接头，所述接头为单链DNA，所述接头和所述cDNA链的3’为单链末端互补，所述接头比该互补单链末端长；

任选的，所述接头比所述cDNA链的3'末端的单链末端长10bp～60bp；

任选的，长20bp～50bp；

任选的，所述接头如SEQ ID NO:3所示。

6.一种RNA文库，其特征为，所述RNA文库通过权利要求1-5任一所述方法制备获得。

7.一种RNA测序方法，其特征为，包括如下步骤：

探针捕获权利6所述的RNA文库中的DNA，形成探针-DNA杂合体；

对探针-DNA杂合体体进行测序，获得所述DNA序列信息；

根据DNA序列信息以确定至少一部分所述RNA序列信息；

所述探针与第一预设序列互补配对。

8.根据权利要求7所述的测序方法，其特征在于，在固相基质上进行所述测序，所述固相基质上带有探针；

任选的，对所述RNA文库进行变性处理，获得单链DNA；

任选的，通过加入测序引物进行所述测序，所述测序引物的序列与第二预设序列一致。

9.一种RNA测序试剂盒，其特征在于，用于实施权利要求1-5任一方法或用于实施权利要求7或8所述的测序方法，包含所述探针、反转录酶、接头；

所述接头为单链DNA或双链DNA，所述探针与第一预设序列互补配对。

10.根据权利要求9所述的测序方法，其特征在于，所述试剂盒还包含连接酶，所述连接酶用于双链DNA与RNA/DNA杂合双链的连接；

任选的，所述反转录酶为M-MμLV酶及其工程酶；

任选的，所述接头为双链DNA；任选的，所述接头为Seq ID NO.1和Seq ID NO.2所示序列；

任选的，所述接头为单链DNA；任选的，所述接头为Seq ID NO.3所示序列；

任选的，所述探针为Seq ID NO.4所示序列。