[发明专利]一种快速提取细菌基因组DNA的方法

说明书

本发明公开了一种快速提取细菌基因组DNA的方法，步骤只有破壁、沉淀、干燥与溶解三步，大大简化了细菌基因组提取步骤，且提取时间仅需15‑30min即可完成细菌基因组DNA的提取。本发明方法明显降低了对实验设备的要求及提取成本，减少了劳动力的投入，具有省时、省力、省钱、简单、安全的优点，应用前景广阔。

技术领域

本发明涉及一种提取基因组DNA的方法，尤其涉及一种快速提取细菌基因组DNA的方法，属于生物技术领域。

背景技术

伴随着生物化学及分子生物学如分子克隆技术、PCR技术、基因工程以及全基因DNA测序技术等的发展，对生物DNA的研究也越来越广泛与深入。而基因组DNA的提取往往是对生物DNA研究的第一步，也是研究的基础，DNA的提取质量直接决定着下游实验的成败。

细菌属于原核生物，其细胞结构比较简单，具有肽聚糖构成的坚韧细胞壁。对细菌DNA提取的第一步需要破坏这层细胞壁，而释放细胞内的核酸等内容物，目前对细菌基因组DNA提取的方法主要有：机械破碎法、酶法和化学法等进行细胞破碎以及DNA提取。其中机械法主要是利用机械作用力如超声破碎、反复冻融、微珠震荡等方法对细菌细胞壁进行破碎；酶法主要通过生物酶如溶菌酶等对细菌细胞壁进行溶解破碎；化学法通过化学试剂如强碱NaOH、表面活性剂SDS(十二烷基磺酸钠)、CTAB等化学试剂对细菌进行破裂、蛋白变性等结合有机溶剂抽提蛋白杂质，从而获得较高纯度的DNA。

目前对细菌基因组提取最常用的方法即CTAB-酚氯仿抽提法，由于其操作所用的试剂方便易得，无需用到复杂的实验仪器，价格相对低廉，因而成为细菌基因组DNA主要的提取方法。其主要提取步骤包括：收集菌体、破壁、抽提、沉淀、洗涤、干燥、溶解等多步，其主要方法包括(以提取大肠杆菌基因组DNA为例进行介绍)：收集菌体1、划线菌种至LB固体培养基，置于37℃培养箱倒置培养过夜待长出菌落后，挑取菌落至LB液体培养基，37℃摇培约12小时至稳定生长期，取1.5mL菌液至2mL离心管，12000rpm，离心5min，弃上清，收集菌体；破壁2、加入600μL 1X TE溶液重悬菌体，12000rpm，离心5min，弃上清；3、加入450μL1 X TE溶液、50μL 10mg/mL溶菌酶和10μL 100mg/mL的蜗牛消化酶与菌体混匀，37℃孵育1h；4、加入600μL TENS裂解液，以及与沉淀等体积的玻璃珠，混匀，涡旋震荡10min后，加入30μL20mg/mL蛋白酶K，混匀，55℃孵育1h，5、4℃12000rpm，离心5min，转移上清至新的1.5mL离心管；抽提6、加入等体积的有机溶剂酚、氯仿、异戊醇(25：24：1)充分混匀，静置2min后，4℃，12000rpm，离心5min；沉淀7、转移上清至新的1.5mL离心管，加入0.8倍体积的异丙醇，-20℃沉淀2h，4℃，12000rpm，离心5min，弃上清。洗涤8、加入600μL预冷的70％的乙醇，颠倒混匀，洗涤DNA沉淀，12000rpm，离心5min，弃上清，并重复洗涤1次。干燥及溶解9、吸干离心管中的液体，晾干，加入30μL无菌水及0.5μL 10mg/mL的RNaseA，混匀保存至-20℃冰箱。其中TENS裂解液成分：100mM Tris-HCl(pH8.0),50mM EDTA，200mM NaCl，2％(w/v)SDS(十二烷基磺酸钠)，0.5％(v/v)TritonX-100。然而此方法比较费时费力，所用试剂较多，一些试剂如酚、氯仿、异戊醇等有机溶剂有毒，且有刺激性气味，需在通风橱中操作，一些酶的价格较贵，花费较多，投入成本较大，且整个过程步骤较繁琐，花费时间较长，整个提取过程需要花费4、5个小时才能完成，影响实验进程。基于此，亟待对提取DNA方法进行优化，使其能简易、方便、快捷，缩时、低成本，并且保证DNA的产量、质量，能够使提取的DNA进行下游的PCR、菌种鉴定等实验。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明对之前的细菌DNA提取方法进行了优化，提供一种快速提取细菌基因组DNA的方法。

本发明所述的快速提取细菌基因组DNA的方法，步骤是：