[发明专利]一种用于提取微量药用植物样品DNA的提取液及其提取方法

说明书

本发明公开了一种用于提取微量药用植物样品DNA的提取液及其提取方法，该提取液包括Tris‑HCl10～20mmol/L、EDTA0.5～1mmol/L、KCl0.1～0.2mol/L以及RNA酶5～10mg/L。该提取液可用于提取多种药用植物的叶、茎、根及花等多种组织的微量样品基因组DNA，适用性广；使用该方法提取的基因组DNA可以有效地用于目的片段PCR扩增和DNA条形码分子鉴定等用途。与现有技术相比，本发明方法具有适用性广，所需样品量少，不含高毒、剧毒成分，成本低，操作简便、快速，易于掌握等优势，为基于DNA条形码的药用植物微量样本的基因组DNA提取及分子鉴定提供了新的方法，助推了中药分子鉴定技术的发展和普及。

技术领域

本发明涉及DNA提取技术领域，更具体地说，它涉及一种用于提取微量药用植物样品DNA的提取液及其提取方法。

背景技术

中药材品种广泛，且来源复杂，普遍存在多基源的情况，致使中药在生产、流通和临床使用过程中普遍存在药品同名异物、同物异名、鉴定不清、替代混用、以假乱真、以次充好等现象，严重影响了中药临床用药过程中的安全性和有效性。药材的准确鉴定是保证中药质量和临床用药安全有效可控前提和基础。为解决现代中药行业对中药材基原物种鉴定的需求，DNA条形码分子鉴定技术被应用至中药材鉴定领域，在中药基源物种及中药材鉴定等方面均取得了突出成绩，促进了中药标准化鉴定的进程。随着中药材DNA条形码分子鉴定方法研究的深入与普及，国家药典委员会讨论通过在《中国药典》增补本中列入中药材DNA条形码分子鉴定指导原则(即以ITS2为核心，psbA-trnH为辅的植物类药材DNA条形码鉴定体系和以COI为主、ITS2为辅的动物类药材DNA条形码鉴定体系)，使中药材DNA条形码鉴定进一步规范化。目前，中国中医科学院陈士林研究团队已经构建了较完备的在线中药材DNA条形码鉴定系统，将目的序列导入该数据库便可快速准确地实现物种鉴定(参照文献：陈士林.中国药典中药材DNA条形码标准序列[M].北京:科学出版社,2015.)。

DNA条形码技术流程通常包括样品处理、样品DNA提取、PCR扩增、DNA测序、序列拼接、鉴定分析六个环节，其中获取高质量的样品DNA被认为是DNA条形码技术的必要前提和关键环节。而药用植物大多含有较多的次生代谢产物，严重影响了基因组DNA的提取效率和质量。

对于药用植物而言，常用基因组DNA提取法包括CTAB法、碱裂解法、高盐低pH法等。前三种提取方法均需在提取试剂和提取过程中通常通过加入NaOH、SDS、Ttiton-X 100、β-巯基乙醇和三氯甲烷等高毒、剧毒试剂提高提取效率和产物质量，对人身健康和环境保护存在较大的安全和环保隐患(参照文献：蒋超,黄璐琦,袁媛,陈敏,林淑芳,吴志刚.使用碱裂解法快速提取药材DNA方法的研究[J].药物分析杂志,2013,33(07):1081-1090；陈璐,王清蓉,敖慧,国锦琳.适合果实类中药的DNA条形码鉴定方法研究[J].辽宁中医杂志,2018,45(05):1028-1030；马敏敏,何芳,杨志刚,蒋丹,仵缘,黄耀江.DNA提取4种中药材方法的筛选[J].中成药,2016,38(08):1776-1781.)。而且添加了SDS或Ttiton-X 100等去垢剂的试剂在剧烈震荡后会产生大量的泡沫，无法使用球磨仪进行磨样，无法适用于批量样品的提取。其中，CTAB法最为繁琐，包括取样、组织破碎、提取缓冲液预处理、裂解缓冲液裂解细胞、去除蛋白质及RNA等杂质、沉淀DNA、漂洗DNA和溶解等环节，程序复杂繁琐、耗时最长，至少需要数小时，对于较难提取的组织甚至需要过夜操作，耗时更大。

对于拟南芥、水稻等模式植物及一些次生代谢产物较少的农作物，大量研究团队采用TPS法提取基因组。相比于上述3种方法，TPS法相对简单，但也需要组织破碎、裂解缓冲液裂解细胞、沉淀DNA、漂洗DNA和溶解等环节，耗时至少1个小时。有报道在棉花中采用了改良TPS法可以缩短提取时间，但是提取试剂中需要添加β-巯基乙醇等有毒试剂，对人体有害。对于次生代谢产物含量高的药用植物，较少采用TPS法提取基因组DNA。