[发明专利]自噬基因Beclin-1在家兔激素股骨头缺血坏死中的表达方法

说明书

自噬基因Beclin‑1在家兔激素股骨头缺血坏死中的表达方法，利用HE染色计数空缺骨陷窝,透射电镜检测骨细胞、成骨细胞自噬型细胞死亡情况，RT‑PCR、western blotting检测Beclin1的mRNA与蛋白表达,免疫荧光检测GFP‑Beclin1蛋白表达；并通过给实验组动物注射3‑MA(3‑Methyladenine,3‑甲基腺嘌呤)来调控这一生物学过程,进一步探讨SANFH的发病机制。结果RT‑PCR:SANFH组的Beclin1 mRNA呈高表达,3‑MA治疗组中骨细胞的Beclin1 mRNA表达量较SANFH组均降低。Western Blot:第一周、第二周SANFH组中Beclin1蛋白高表达,3‑MA治疗组中Beclin1蛋白表达明显下降。免疫荧光染色:SANFH组中骨细胞、成骨细胞的GFP‑Beclin1融合蛋白表达均较对照组升高，给予3‑MA后可以部分减弱GFP‑Beclin1融合蛋白表达。

技术领域

本发明涉及激素股骨头缺血坏死研究领域，特别涉及自噬基因Beclin-1在家兔激素股骨头缺血坏死中的表达方法。

背景技术

股骨头缺血性坏死(osteonecrosis of the femoral head,ONFH)是由于各种原因导致的股骨头血液供应障碍或者细胞变性，进一步恶化发生股骨头的塌陷、结构改变以及关节功能障碍的一种疾病。ONFH通常分为两大类,即创伤性股骨头坏死和非创伤性股骨头坏死，其中非创伤性股骨头坏死以激素性股骨头缺血性坏死(Steroid-inducedavascular necrosis of femoral head，SANFH)为主。自1957年首次报道以来,该病日益增多，病程较长,病因复杂,容易致残。相关研究显示，激素性股骨头坏死临床治疗极其困难,且效果差,因此又有“不死的癌症”之称。激素导致SANFH具有复杂的生物学过程。因此，探明SANFH的发病机制，仍然是该领域研究的重要内容。我们的前期研究结果表明，激素对股骨头节段血管中PDGF与VEGF的超强抑制而引起的血供中断与SANFH存在关联性，诸多促血管生长因子及差异表达基因的调控在SANFH中发挥着重要作用。

近期研究认为，细胞的死亡方式包括程序性细胞死亡和细胞坏死。其中凋亡和自噬为程序性细胞死亡两大主要分型。自噬是体内重要代谢途径，激素与缺血缺氧状态是引起的自噬重要诱因，而激素本身又可以引起细胞缺血缺氧。自噬调控的失调与多种疾病有关，如衰老，炎症性疾病，自身免疫病，肿瘤等。自噬型细胞死亡已成为近期医学领域研究疾病发生发展过程的热门课题。

而在SANFH的发生过程中，股骨头局部发生缺血缺氧改变时骨细胞、成骨细胞会发生怎样的病理变化？其中的骨细胞、成骨细胞的死亡方式是什么？而又有哪些因素可以促进或抑制上述变化的发生，仍然存在诸多疑问。SANFH发生过程中，是否也存在过度的自噬型细胞死亡？在可能导致的骨细胞、成骨细胞自噬型细胞死亡的过程中是否存在Beclin1基因表达增强？3-MA在调控上述病理变化过程中是否也能扮演同样类似的角色？上述所有这些疑点都将成为本次课题研究的重要内容。

应用肾上腺皮质激素引起的SANFH(Steroid-induced avascular necrosis offemoral head，激素性股骨头缺血坏死)具有复杂的生物学过程，其发病机制仍不清楚。自噬型细胞死亡已成为近年来医学领域研究组织器官衰老、死亡、损伤等发病机制的重要研究方向。我们的前期研究结果表明：激素对股骨头节段血管中PDGF与VEGF的抑制而引起的缺血缺氧状态及其众多差异表达基因的调控与SANFH发生存在关联性。推测由激素导致SANFH发生过程中极有可能存在细胞自噬型死亡这一生物学特性。