[发明专利]一种用于治疗耐药肿瘤的靶向细胞外囊泡的制备方法

说明书

本发明公开了一种用于治疗耐药肿瘤的靶向细胞外囊泡的制备方法，包括：1、制备负载DOX的EVs；2、制备具有靶向CD44的透明质酸衍生物；3、将具有靶向CD44的透明质酸衍生物修饰于负载DOX的EVs表面。细胞外囊泡来源于非肿瘤细胞，它可通过抑制组蛋白乙酰化转移酶的蛋白表达来减少耐药基因ABCB1启动子区组蛋白H3的乙酰化水平，从而下调耐药蛋白P‑gp的表达。本发明同时涉及使用连接有十八烷基的透明质酸对细胞外囊泡进行靶向修饰，所得靶向修饰的细胞外囊泡作为药物载体制备工艺简单、生物相容性良好、靶向肿瘤细胞性能好、在肿瘤血管的渗透性增加、逆转肿瘤耐药效果显著，是治疗耐药肿瘤的优良药物载体。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种用于治疗耐药肿瘤的靶向细胞外囊泡的制备方法。

背景技术

肿瘤目前是严重威胁人类健康的常见病，化疗是治疗肿瘤的重要临床手段，然而肿瘤细胞的化疗耐药常常导致化疗失败。耐药形成机制复杂，其中多药耐药基因(ABCB1)编码的P糖蛋白(P-gp)过度表达是细胞产生耐药的主要原因，能量依赖性P-gp能将药物泵出细胞外，减少细胞内药物蓄积，导致肿瘤细胞耐药。

细胞外囊泡是由细胞释放至细胞外环境的直径在50-1000nm之间的膜性囊泡，内含来自母细胞的特异性生物活性分子,如脂质、核酸和蛋白质。鉴于EVs是细胞间信息交流的载体，可被受体细胞有效摄取，它已被作为一类天然的新型药物递送系统运用于不同疾病的治疗。其主要优势在于：1)鉴于它来源于生物体或细胞本身，因此具有良好的生物相容性、极低的免疫原性、可在血液循环中稳定存在；2)可装载多种化疗药物、基因药物及多肽；3)可通过遗传学或化学工程的方式对其进行修饰改造；4)可自由穿越生物体内一些特殊的生理屏障，如血-脑屏障。

目前有研究表明肿瘤源性的EVs具有通过下调P-gp来逆转耐药的潜能，但也有越来越多的研究证实：1)肿瘤源性的EVs可通过横向传递自身携带的促癌基因或蛋白质给受体细胞，从而促进肿瘤的发生；2)可通过促进细胞发生上皮细胞—间充质转换及制造转移前微环境来促进肿瘤转移；3)可通过对机体免疫细胞的调节来介导肿瘤细胞的免疫耐受。因此，需要寻找一种安全、有效、非肿瘤源性的EVs运用于逆转肿瘤耐药的研究。

肿瘤的靶向治疗可使化疗药物特异性杀伤癌细胞的同时，减少其对正常组织的毒副作用。细胞粘附分子CD44是一种多功能细胞表面跨膜糖蛋白，许多肿瘤细胞表面CD44处于高度活化状态，能与其主要配体透明质酸结合，因此CD44可作为理想的靶点分子，用于肿瘤靶向性的诊断与治疗。由于大部分细胞源性的EVs靶向性较差，可通过将具有靶向CD44的透明质酸衍生物修饰在其表面，使其具有靶向性，以增加对耐药肿瘤的治疗效果，但目前鲜有这方面的成熟技术研究。

申请号201811010632.0的发明专利提出了一种构建靶向细胞外囊泡的方法，利用脂质化的适配体或脂质化的抗体等靶向分子来标记磷脂双分子层包裹的细胞(包括哺乳动物来源的细胞、人工合成细胞等等)，待整个细胞膜都携带有适体抗体后，通过机械力来破碎细胞，再分离出直径10-3000nm的EVs。这些EVs因为膜上带有适体或抗体，从而具有靶向性，因此可作为疾病治疗的靶向载体。但是这种先修饰细胞膜，然后使用机械力破碎细胞制备EVs的方式可能会破坏已修饰的靶向分子或造成靶向分子脱落，从而降低EVs的靶向性。其次，没有限定为非肿瘤细胞源性的EVs为药物载体，安全性差，按照上述对肿瘤源性的EVs的分析，仍然不能很好抑制肿瘤。

发明内容

(一)解决的技术问题

本发明的目的在于提供一种用于治疗耐药肿瘤的靶向细胞外囊泡的制备方法，以解决现有技术没有一种安全有效的非肿瘤源性的EVs运用于逆转肿瘤耐药的问题，且先修饰细胞膜，然后使用机械力破碎细胞制备EVs的方式可能会破坏已修饰的靶向分子或造成靶向分子脱落。另外，没有利用具有靶向CD44的透明质酸衍生物修饰在细胞源性的EVs表面的成熟技术研究。

(二)技术方案