[发明专利]一种利用玉米种子快速检测分子特征和品种纯度的方法

说明书

本发明公开了一种利用玉米种子快速检测分子特征和品种纯度的方法，步骤为：(1)玉米种子PCR模板的制备：将玉米种子放水浸泡，取1粒加NaOH溶液，NaOH溶液的溶剂为含有EDTA的水，研碎，加热，冷却至室温，加入Tris‑HCl，涡旋混匀，室温下离心，取上清加入(NH₄)₂SO₄水溶液，于‑20℃存放，即为玉米种子PCR模板；(2)PCR扩增，得到扩增产物；(3)产物检测：将扩增产物电泳分析，得到检测结果。本发明的方法利于储存，稳定性高；实用性强，PCR结果没有明显的差异。所需材料较少、成本较低、操作较简便快捷，能在短时间内处理大量的样本，能对大量玉米样品进行分子特征和品种的种子纯度检测。

技术领域

本发明涉及一种利用玉米种子快速检测分子特征和品种纯度的方法，属于分子生物技术领域。

背景技术

分子生物学技术已经深入到农业育种各个领域，如分子育种可以解决玉米种质资源狭窄的问题，随着转基因作物的不断增多，转基因作物的安全性及分子鉴定也越来越被社会公众广泛关注，因此转基因检测技术也成为了研究热点，需要不断完善与发展。在粮食中进行转基因成分的检测，目前大多是在DNA、RNA和蛋白质水平，但在应用中后两者检测方法局限性较大。其中，基于核酸水平上的检测方法有PCR法、分子杂交技术、芯片检测法等，在应用中最常用的方法为PCR法。

种子纯度分子检测技术以品种DNA序列作为检测对象，通过PCR扩增目的片段，采用电泳技术检测DNA结构和组成上的差异。利用PCR技术来分析DNA水平的差异从而进行种子纯度检测，可以用于种子真实性和品种纯度的检测。

现有技术，DNA作为PCR反应的模板，其提取方法耗时长，在很大程度上影响着整个检测程序的效率与重复率。目前，在植物中已有大量的关于基因组DNA提取方法的报道，可以从植物叶片、果实、幼苗等中提取DNA，常用的DNA提取方法为CTAB法。这些方法存在较多的局限性，例如取样量较大、耗时长、步骤多、高毒物质较多、价格昂贵，同时处理大批样品时工作量较大，不适合应用于快速检测。

在基于PCR技术的品种分子特性检测和品种纯度等方面的研究中，基因组DNA模板的质量要求较低，在检测量较大时耗时太大，而且其中大多数样品只会进行一次PCR反应，因此建立一种快速简单的直接PCR扩增方法十分有必要。

碱性裂解法是一种可有效提取植物DNA的方法，其工作原理是利用碱液使细胞膜蛋白变性，DNA被释放出来，从而分离DNA。现有的碱性裂解法方法多以叶片或幼苗为材料。通过玉米种子发芽获得叶片所需的时间较长，且玉米种子更加稳定，更易于储存。不同的植物组织应选择适宜的处理方法，现有的碱性裂解法只适用于植物幼苗和叶片，因此，亟需一种操作简单，快速的玉米种子PCR模板的制备方法，节省玉米萌发产生幼苗的时间，并能够快速检测玉米分子特征和品种的种子纯度。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种利用玉米种子快速检测分子特征和品种纯度的方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种利用玉米种子快速检测分子特征和品种纯度的方法，包括如下步骤：

(1)玉米种子PCR模板的制备：将玉米种子放于水中，浸泡2-48h，取1粒浸泡后的玉米种子，放入Eppendorf管中，加入100-400μL0.1-0.4mol/LNaOH溶液，所述NaOH溶液的溶剂为含有终浓度0.5-1.5mmol/L EDTA的水，研碎玉米种子，在65-100℃水中间接加热1-30min，冷却至室温，加入50-150μL 1mol/L，pH＝8.0的Tris-HCl，涡旋混匀，室温下离心，取上清加入100μL，10-30mmol/L(NH₄)₂SO₄水溶液，于-20℃存放0.5-48h，即为玉米种子PCR模板；