[发明专利]一种犬用乳酸菌及信号分子联用制剂及其制备方法

权利要求书

1.一种犬用乳酸菌及信号分子联用制剂的制备方法，其特征在于，所述联用制剂的制备方法包括以下步骤：

1）培养乳酸菌：用移液枪吸取100~1000μL乳酸菌冻存液均匀涂布于固体培养基中，30~37℃静置培养至长出单菌落；在固体培养基中挑取单菌落，接种于液体培养基中，于30~37℃环境下静置培养24~48小时得到培养菌液，再将培养菌液与液体培养基按1：50~100的比例转接，继续30~37℃静置培养24~48小时，使得液体培养基中活菌浓度达到10⁸ CFU/mL；

2）冷冻离心富集处理：将上述10~100 mL培养后的菌液转移至无菌离心管中，用离心机在4~10℃，转速4000~6000 g下离心3~7 min,弃上清，用0.85 %无菌生理盐水洗涤一次，离心去除液体，剩下菌泥，将菌泥重悬于1~10 mL冻干保护剂中获得悬菌液，使其浓度达到10⁹CFU/mL，再将其置于无菌西林瓶中，使用灭菌纱布进行封口；

3）冷冻干燥处理：将装有悬菌液的西林瓶和真空冷冻干燥机配套的铁托盘在置于-40~ -80 ℃冰箱内预冻2~12 h；将装有悬菌液的西林瓶放置在铁托盘上，共同放入FDU-1100型号的真空冷冻干燥机，在-30 ~ -40 ℃，30~40 MPa下冷冻干燥24~48 h后，制备得到乳酸菌冻干菌粉；

4）添加信号分子：将信号分子——液态2型自体诱导物（（S)-4,5-Dihydroxy-2,3-pentandione (DPD, Autoinducer 2)）用注射器吸取，并注射入上述盛有冻干菌粉的西林瓶中，使信号分子终浓度达到0.005 ~ 0.01 g/L，制备得到乳酸菌及信号分子联用制剂，并至于-20 ~ -80℃ 冰箱保存。

2.根据权利要求1所述的一种犬用乳酸菌及信号分子联用制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤1）的所述乳酸菌可以为Lactobacillus plantarum LR-1（植物乳杆菌LR-1）；所述固体培养基可以为MRS固体培养基；所述液体培养基可以为MRS液体培养基。

3.根据权利要求1所述的一种犬用乳酸菌及信号分子联用制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤2）中的采用的冻干保护剂为无菌脱脂乳；所述离心机为德国Eppendorf公司的AG22331型离心机。

4.根据权利要求1所述的一种犬用乳酸菌及信号分子联用制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤3）中所述真空冷冻干燥机可以为FDU-1100型号的真空冷冻干燥机。

5.一种由权利要求1-4任一项所述方法制备的犬用乳酸菌及信号分子联用制剂。