[发明专利]实时监测单细胞或单细胞的活动

说明书

本发明包括的一种可以产生能够连续培养单个细胞的装置和培养单个细胞的装置和方法,利用该装置可以时时动态监测细胞的生理状况。

本发明主张美国临时申请，申请号：62/733,790申请日2018年9月20日的优先权，该临时申请的所有文字描述和附图以及说明书作为本发明的一部分。

本发明领域

本发明涉及利用微流体平台以实时方式监测或检测单个细胞的活动或特性的方法和/或装置。

本发明的背景

常规细胞研究调查了约10³-10⁶个细胞的细胞群的平均生理特征，因而仅揭示了该群体的平均基因型/表型特征。然而细胞间差异(例如，即在看似相同的细胞群体内的细胞间变异现象)实际上是生物系统的普遍特性，并且已经从单个细菌细胞到人类组织的各级生命层次中观察到。

更重要的是，疾病通常源自组织内少数细胞的异常。对足够数量的单个细胞的分析可以揭示细胞异常/表型异质性的遗传变异、及高分辨率情况下对环境刺激及化学治疗剂刺激的应答。这对了解细胞功能和功能障碍、靶向特异细胞类型、药物筛选、异常分析、酶分析和疾病早期诊断的潜在的分子机制是很重要的。由于其高成本和复杂性，依赖多孔板和机器人技术的常规的单细胞分析方法仅能处理和分析少量细胞。非常需要采用超高通量的方法来描绘百万个细胞的特征，特别当要分析或筛选的重要细胞类型在样品中以非常低的丰度存在时。

液滴微流体技术提供了以非常高通量的方式单分散性离散化来分离单个细胞和试剂，从而允许高效处理和分析数万至数百万个细胞。此外，少量液滴就可以获得非常经济的大量筛选。乳化聚合酶链式反应(ePCR)可以通过将核酸(DNA或RNA)分配到散布在油相中的小液滴进行大规模平行的单拷贝PCR反应，为单细胞的高通量基因检测提供了强大的工具，从而实现单细胞分析。基于液滴微流体的单细胞分析目前在阐明细胞群体的异质性和其潜在原因中发挥着越来越重要的作用。

基于激光的流式细胞仪已经用于单细胞的表型特征分析，例如酶、生物标志物和对药物筛选的应答能力。它使用激光分析荧光分子的存在和单个细胞的光散射属性，因为它们以每秒数万个细胞的速率通过依次通过检测器。荧光显微镜是一种更动态的方法。固定在微流体装置中的荧光显微镜为单细胞研究开辟了许多新的可能性，因为在微流体装置中可以精确控制和修改单细胞所经受的环境。然而，一些重要的单细胞分析，例如延时追踪特定细胞，分泌物的分析以及对单独的细胞或克隆的分析，由于这些技术缺乏对单个细胞稳健的离散而超出了流式细胞术和荧光显微镜方法的范围。

为了单细胞的基因型特性分析，通过荧光激活细胞分选系统将单个细胞分离到孔板的每个孔中。通过聚合酶链式反应(PCR)或逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和遗传检测或全基因组测序，提取扩增单个细胞的DNA/RNA，以获得单个细胞的遗传信息。由于其成本和复杂性，该方法仅能处理和分析少量细胞。

最近，液滴微流体的高通量和卓越的可控性，大量平行的单细胞PCR或RT-PCR可以在微流体液滴中进行，用于单细胞遗传分析。这样的方法依赖终止时间检测来鉴定每一个细胞的稀有突变基因，如数字PCR技术那样。然而跨细胞群的每一个细胞的遗传信息如信使RNA(mRNA)的变化不仅在于表达的存在或缺乏，而且在于表达水平，当前技术不能以定量的方式区分mRNA表达水平。更重要的是，目前仍缺乏能确定和分析单个细胞表型和基因型特性的方法。

发明内容

本发明首次引入了利用微流体平台以实时方式监测和检测单个细胞中的活动或细胞特性的概念，从而使得对细胞功能及功能缺陷潜在的分子机制有着更深入的了解。

在一个实施例中，本发明提供了以大规模平行且实时的方式监测和检测单个细胞中的活动或细胞特性的方法和装置。

在一个实施例中，本发明提供了在单个细胞水平单独的培养并检测大量细胞的单细胞培养系统，包括离散细胞群体为很多单个凝胶微球中，而每一个凝胶微球包含单个细胞，且被加载入一个培养室用来培养和后续测试或分析。