[发明专利]用汉逊酵母表达系统产生HPV31 L1蛋白的方法

说明书

本发明涉及用汉逊酵母表达系统产生HPV31 L1蛋白的方法。具体地，本发明公开了产生表达HPV31 L1蛋白的重组汉逊酵母细胞的方法以及由所述方法产生的重组汉逊酵母细胞。本发明还公开了利用所述重组汉逊酵母细胞产生HPV31 L1蛋白的方法以及所产生的HPV31 L1蛋白在制备预防性疫苗中的用途。

本申请为申请日为2013年5月17日、申请号为201310185027.8、发明名称为“用汉逊酵母表达系统产生HPV31 L1蛋白的方法”的发明专利申请的分案申请。

发明领域

本发明属于医药生物工程技术领域，涉及产生HPV31 L1蛋白的方法，尤其涉及用汉逊酵母表达系统产生HPV31 L1蛋白的方法。

背景技术

人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是一种无包膜的闭环双链DNA病毒，属乳多空病毒科多瘤病毒亚科，主要侵犯人体的上皮黏膜组织，进而诱发各种良性及恶性增生病变。

目前已鉴定出来的不同亚型HPV超过200种，HPV感染具有明显的组织特异性，不同型别的HPV对于皮肤和黏膜的嗜向性不同，能诱发不同的乳头状病变，大约有30多种HPV型别与生殖道感染有关，其中有20多种与肿瘤相关。根据HPV诱发病变的良恶性不同，HPV可大致分为两类：1)高危型(如HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68等)：高危型HPV与人类多种组织恶性肿瘤密切相关，主要引起重度不典型增生和浸润癌；2)低危型(如HPV6、HPV11、HPV40、HPV42、HPV43、HPV44、HPV54、HPV72、HPV 81等)：低危型HPV可引起表皮细胞良性增殖性性病，如尖锐湿疣和扁平湿疣等。

HPV主要由病毒外壳和基因组DNA构成。基因组长约7900bp，有8个病毒蛋白编码基因。其中6个ORF编码的蛋白在病毒复制的早期表达，称为早期蛋白；2个ORF编码的蛋白在病毒复制的晚期表达，称为晚期蛋白。晚期蛋白包括主要外壳蛋白L1及次要外壳蛋白L2，并参与病毒外壳的形成。

HPV病毒外壳蛋白能够进行自组装，在多种表达系统中单独表达的L1蛋白或将L1蛋白与L2蛋白共表达时均能自组装成病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)，其中以在酵母系统、杆状病毒昆虫表达系统及哺乳动物细胞表达系统等产生的VLP更接近天然病毒的结构。利用外源表达体系生产的VLP免疫后能够在体内诱发产生中和抗体，获得良好的免疫保护效果。

多形汉逊酵母(Hansenula Polymorpha)，又称作Pichia augusta，是当前公认的最为理想的外源基因表达系统之一。多形汉逊酵母作为单细胞真核微生物，既具备原核生物生长快速、易于遗传操作等特点，又有真核细胞翻译后加工和修饰等功能。此外，汉逊酵母还具备安全性好、易于培养、成本低廉、表达量高及遗传稳定等优势，并且能够克服诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株不稳定、产量低及糖基化侧链过长以及毕赤酵母(Pichia Pastoris)外源基因整合拷贝数较低的问题。目前，应用汉逊酵母表达系统生产的药物(如胰岛素，商品名Wosulin)及HBV疫苗(商品名Hepavax-Gene)均已上市销售。

在中国发明专利公开CN102586287A及CN102719453A中公开了应用汉逊酵母表达系统表达HPV16及HPV18型别L1 VLP的方法。然而关于HPV31型别的L1蛋白是否可在汉逊酵母系统中实现高效表达并组装成VLP颗粒，目前并没有公开报道。在上述2篇已公开的专利申请中，未给出HPV16及HPV18 L1的外源基因整合拷贝数的结果及提高外源基因拷贝数的方法。在外源蛋白的诱导表达方面，HPV16及HPV18 L1在发酵罐中的诱导时间均需超过20小时，且没有提供蛋白表达水平的具体信息。此外，作为一个重要蛋白纯化指标，关于纯化过程及纯化完成时外源蛋白HPV16及HPV18 L1的纯度也没有公开。