[发明专利]一种生产羟基酪醇的工程菌及其应用

说明书

本发明公开了一种生产羟基酪醇的工程菌及其应用，属于生物工程技术领域。本发明的基因工程菌导入了L‑苯丙氨酶脱氢酶、α‑酮酸脱羧酶、醇脱氢酶的基因，可应用于生物合成羟基酪醇。本发明还公开了重组大肠杆菌基因工程菌的构建方法和应用。利用本发明的重组菌转化生产羟基酪醇的方法，具有操作简单，成本低，产物合成效率高的特点，具有良好的产业化前景。

技术领域

本发明涉及一种生产羟基酪醇的工程菌及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

羟基酪醇(3,4-二羟基苯乙醇，Hydroxytyrosol，3,4-Dihydroxyphenylethanol，2-(3,4-Dihydroxyphenyl)ethanol)，是一种天然的多酚类化合物，具有很强的抗氧化活性，主要以酯类的形式存在于橄榄的果实和枝叶中。羟基酪醇苯环上连接有两个羟基，是其主要的抗氧化活性基团，因其固有的抗氧化活性可预防多种疾病的发生。除此之外，羟基酪醇还可消除体内自由基，恢复人体脏腑器官的健康状态，防止脑衰，延缓衰老。

近几年的研究表明，羟基酪醇对多种疾病有明显的作用，羟基酪醇在糖脂代谢调节、防治肿瘤、抗血栓、缓解动脉硬化、抑制病原微生物、防治视网膜黄斑变性、保护软骨和防治骨质疏松等方面都具有良好的生物活性。随着人们对羟基酪醇生物学活性及体内代谢特征的不断研究，越来越多的生物活性被开发出来，这些研究也受到国内外研究者的广泛关注。

目前羟基酪醇的工业化生产还不成熟，且大都处于实验室阶段。其小量制备主要有以下两种方式：1)通过酸解或酶解橄榄厂的废水、橄榄叶、原生橄榄油中的橄榄苦苷，再进一步获得羟基酪醇；2)利用化学合成的方法制备羟基酪醇。利用生产橄榄油产生的废水制备羟基酪醇，既能进行废物利用，又能减少对环境的污染。但是此方法需要大量的溶剂，并且羟基酪醇的回收率不高。通过化学合成的方法虽然能成功合成羟基酪醇(CN201110357075.1、CN201210342015.7)，但由于原料和试剂成本昂贵，反应过程中产生许多副产物，并且合成步骤较长，反应剧烈不易控制等缺点，使得化学合成方法不适合工业化生产。除此之外，由于羟基酪醇是重要的食品、药物、保健品的原材料，因此通过化学方法得到的产品不受人们欢迎。目前市场上的这一类物质主要从植物中提到得到，例如，中国发明专利CN201610883391.5公开了一种橄榄叶羟基酪醇的提取工艺；中国发明专利CN201710195462.7从橄榄叶中提取羟基酪醇的方法。由于植物资源及其含量的限制，并且提取过程繁琐、复杂，使得这些产品价格昂贵，因此通过微生物法生产受到了广泛的关注。

2012年，Yasuharu Satoh等人提出以酪氨酸为底物，在酪氨酸羟化酶的作用下生成L-多巴，L-多巴在L-多巴脱羧酶作用下生成多巴胺，接着在酪胺氧化酶作用下生成3,4-二羟基苯乙醛，再在醇脱氢酶作用下生成羟基酪醇，(Engineering of l-tyrosineoxidation in Escherichia coli and microbial production of hydroxytyrosol,Metab.Eng.14(6)603-610(2012))。通过构建含有不同基因的大肠宿主得到一株菌，分别以1mM酪氨酸为底物生成0.19±0.0056mM羟基酪醇，以1mM L-多巴生成0.74±0.088mM羟基酪醇。国际发明专利WO2017US39329(HOST CELLS AND METHODS FOR PRODUCINGHYDROXYTYROSOL)也公开了两株宿主细胞共同培养发酵酪氨酸产羟基酪醇的方法，首先在第一个宿主细胞的作用下产生L-多巴，进一步在产生羟基酪醇。这一种制备羟基酪醇的方法大多采用来源于人或小鼠的基因，致使基因在大肠宿主或其他异源宿主中的表达不兼容。