[发明专利]一种具有成骨活性的贻贝肽冻干粉的制备方法

权利要求书

1.一种具有成骨活性的贻贝肽冻干粉的制备方法，其特征在于，包括步骤：

S1、贻贝水提粗蛋白的制备：取贻贝肉6000～12000rpm、匀浆3～10min，得贻贝浆，加水，1～25℃静置2～8h，离心取上清液A，即为水提粗蛋白；其中，所述贻贝浆和水的重量体积比为：1:3～5g/ml；

S2、脱盐：将步骤S1所述水提粗蛋白离心，收集上清液B，将所述上清液B用1000～3000D的透析袋和水进行透析脱盐，得到水提脱盐贻贝蛋白；将所述水提脱盐贻贝蛋白进行冷冻干燥，得到水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉；

S3、酶解：将步骤S3所述水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉，按料液重量比1:30～100加水复溶成溶液A，向所述溶液A中加入中性蛋白酶，在30～60℃、50～70rpm搅拌酶解2～6小时，所得酶解产物溶液为具有成骨活性的贻贝混合肽；将所述贻贝混合肽进行冷冻干燥，得具有成骨活性的贻贝肽冻干粉；其中，中性蛋白酶的添加量以所述溶液A中水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉总重量为基准，每克水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉加入中性蛋白酶4000～6000U。

2.根据权利要求1所述具有成骨活性的贻贝肽冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤S1所述离心具体为：6000～12000g、5～30min。

3.根据权利要求1所述具有成骨活性的贻贝肽冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤S2所述离心具体为：6000～12000g、5～30min。

4.根据权利要求1所述具有成骨活性的贻贝肽冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤S2所述透析具体为，将所述上清液B置于1000～3000D的透析袋中，使用双蒸水对其进行透析，所述双蒸水的用量为上清液B体积的100～150倍，每6～12h更换一次双蒸水，共透析24～36h。

5.根据权利要求1所述具有成骨活性的贻贝肽冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤S2所述冷冻干燥的时间-温度程序设置如下，第一段：-60℃～-50℃冷冻3～5小时，第二段：-45℃～-40℃冷冻1～3小时，第三段：-30℃～-25℃冷冻1～2小时，第四段：-10℃～-5℃冷冻1～2小时，第五段：5℃～15℃干燥1～2小时，第六段：15℃～20℃干燥1～2小时，第七段：20℃～25℃干燥1～2小时；在第二段进行抽真空，所述第二段至第七段的真空度在15～25Pa；真空泵启动温度为-60℃～-50℃，隔板温度设定为-30℃～-20℃。

6.根据权利要求1所述具有成骨活性的贻贝肽冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤S3所述酶解的转速为50～75rpm。

7.根据权利要求1所述具有成骨活性的贻贝肽冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤S3所述冷冻干燥的时间-温度程序设置如下，第一段：-60℃～-50℃冷冻3～5小时，第二段：-45℃～-40℃冷冻1～3小时，第三段：-30℃～-25℃冷冻1～2小时，第四段：-10℃～-5℃冷冻1～2小时，第五段：5℃～15℃干燥1～2小时，第六段：15℃～20℃干燥1～2小时，第七段：20℃～25℃干燥1～2小时；在第二段进行抽真空，所述第二段至第七段的真空度在15～25Pa；真空泵启动温度为-60℃～-50℃，隔板温度设定为-30℃～-20℃。

8.根据权利要求1所述具有成骨活性的贻贝肽冻干粉的制备方法，其特征在于，包括步骤：

S1、贻贝水提粗蛋白的制备：取500g贻贝肉10000rpm、匀浆5min，得贻贝浆，加水1500mL，4℃静置6h，然后置于10000g离心10min，取上清液A，即为水提粗蛋白；

S2、脱盐：将步骤S1所述水提粗蛋白置于10000g离心10min，收集上清液B，将所述上清液B用置于1000D的透析袋中，使用双蒸水对其进行透析，所述双蒸水的用量为上清液B体积的100倍，每6h更换一次双蒸水，共透析24h，得到水提脱盐贻贝蛋白；将所述水提脱盐贻贝蛋白进行冷冻干燥，得到水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉；

所述冷冻干燥的时间-温度程序设置如下，第一段：-60℃冷冻2小时，第二段：-45℃冷冻3小时，第三段：-30℃冷冻2小时，第四段：-5℃冷冻1小时，第五段：5℃干燥1小时，第六段：20℃干燥1小时，第七段：25℃干燥1小时；在第二段进行抽真空，所述第二段至第七段的真空度在15Pa，真空泵启动温度为-60℃，隔板温度设定为-30℃；

S3、酶解：将步骤S3所述水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉10g加水1L，复溶成溶液A，向所述溶液A中加入中性蛋白酶5000U/g_{水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉}，共加入中性蛋白酶50000U，45℃、60rpm搅拌酶解4小时，所得酶解产物溶液为具有成骨活性的贻贝混合肽；将所述贻贝混合肽进行冷冻干燥，得具有成骨活性的贻贝肽冻干粉；

其中，所述冷冻干燥的时间-温度程序设置如下，第一段：-60℃冷冻2小时，第二段：-45℃冷冻3小时，第三段：-30℃冷冻2小时，第四段：-5℃冷冻1小时，第五段：5℃干燥1小时，第六段：20℃干燥1小时，第七段：25℃干燥1小时；在第二段抽真空，所述第二段至第七段的真空度在15Pa，真空泵启动温度为-60℃，隔板温度设定为-30℃。