[发明专利]噬菌体裂解酶复合粉剂及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种噬菌体裂解酶复合粉剂，其组成物及质量百分比为噬菌体裂解酶TSPpgh 0.15‑0.2%、噬菌体裂解酶MMPpgh 0.15‑0.2%、海藻糖0.3‑0.5%、柠檬酸0.1‑0.2%、甘露醇0.2‑0.3%、维生素C 0.2‑0.3%、硅藻土98.3‑98.9%；该噬菌体裂解酶复合粉剂采用双层平板法进行体外抑菌活性检测，在常温下储存12个月且酶活保持在95%以上（酶活损失在5%以内）；该复合裂解酶制剂可用于替代抗生素抑制动物肠道内大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等有害病原菌的增殖，维持肠道微生态平衡。

技术领域

本发明属于酶制剂技术领域，具体涉及一种噬菌体裂解酶复合粉剂及其制备方法和应用。

背景技术

噬菌体裂解酶是一类细胞壁水解酶，可水解肽聚糖，噬菌体侵染宿主后，双链 DNA噬菌体通过穴蛋白-裂解酶裂解系统破坏细菌细胞壁结构，从而使宿主菌破裂。裂解酶一般具有两到三个结构域，参与对底物的催化和结合。作为一种新型的杀菌制剂，裂解酶的高亲和性与种属特异性的细胞壁糖基有关，而后者是细菌存活的必要成分，所以细菌难以对裂解酶产生抗性，自然界中，几乎所有的细菌都有相应的噬菌体，所以裂解酶的开发研究具有重要的价值。噬菌体裂解酶裂解细菌的方式有“自内裂解” ( lysis from interior ) 和“自外裂解 ”( lysis from external) 两种方式，当纯化的噬菌体裂解酶和宿主混合培养时，裂解酶通过降解细菌细胞壁肽聚糖，从而使细菌裂解死亡。噬菌体裂解酶独特的抑菌机理使其有望替代抗生素用于治疗细菌感染，并可用于清除动物肠道内特定的有害菌群，维持动物肠道健康。

长期以来用做饲料添加剂的抗菌药物有磺胺类、四环类、青霉素、氯霉素、金霉素、卡那霉素、庆大霉素等，其危害主要表现在（1）导致细菌产生抗药性；（2）造成畜禽机体免疫力下降；（3）引起畜禽内源性感染和二次感染；（4）在畜禽产品中造成残留。

抗生素的滥用还导致的食品安全和健康问题日趋严重，欧盟在2006年已经禁止在饲料中添加抗生素，中国也将在2020年全面禁止在饲料中添加抗生素；裂解酶作为一种新型杀菌剂，具有主要的3大特性；（1）特异性。裂解酶只裂解其宿主菌，对其他菌株没有杀灭作用，作为一种抗菌药，裂解酶的特异性可以有效的避免菌群失调的发生。（2）高效性。裂解酶与抗生素相比有较强的杀菌活性。裂解同等量的菌株，裂解酶的灭菌效率是抗生素的12-24倍，而且可以消除生物膜。（3）安全性。在单剂量毒性实验中，实验动物未出现任何不良反应，重要器官及组织也未见严重的炎症反应及其他病变，且裂解酶不易产生抗药性。有望取代抗生素成为动物肠道抑菌的又一途径。

噬菌体裂解酶属于蛋白酶类，在直接投喂的过程中容易受到胃酸、胆盐的干扰；此外，动物胃肠道内大量的胃蛋白酶和胰蛋白酶会把噬菌体裂解酶分解，造成其活性丧失；且噬菌体裂解酶氨基酸上的残基容易被氧化，导致活性降低。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种噬菌体裂解酶复合粉剂，其组成物及质量百分比为噬菌体裂解酶TSPpgh 0.15-0.2%、噬菌体裂解酶MMPpgh 0.15-0.2%、海藻糖0.3-0.5%、柠檬酸0.1-0.2%、甘露醇0.2-0.3%、维生素C 0.2-0.3%、硅藻土98.3-98.9%。

上述噬菌体裂解酶复合粉剂的制备方法为：按常规方法，分别构建含有噬菌体裂解酶TSPpgh基因的基因工程菌和含有噬菌体裂解酶MMPpgh基因的基因工程菌，将构建成功的基因工程菌在35-38℃、100-300rmp/min下培养10-12h至基因工程菌的生物量OD₆₀₀=30-35，然后用乳糖进行诱导，诱导时间5-6h后，去除培养基，用磷酸缓冲盐溶液重悬，在压力1000-1100 bar下进行高压匀浆破碎，离心收集上清液并用孔径为0.22μm滤膜过滤，在无菌条件下将含有裂解酶TSPpgh的上清液、含有裂解酶MMPpgh的上清液与海藻糖、柠檬酸、甘露醇、维生素C、硅藻土混匀，干燥至含水量为8-10%，获得噬菌体裂解酶复合粉剂。