[发明专利]一种小鼠胚胎成纤维细胞伽马射线辐照后可长期传代细胞株及其构建方法

说明书

本发明涉及生物医学技术领域，具体是一种小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)伽马射线辐照后可长期传代细胞株及其构建方法。本发明采用小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)为诱导对象，对其使用特定剂量(10Gy)伽马射线辐照，小鼠胚胎成纤维细胞辐照后，细胞增殖减慢，凋亡增加，迁移能力减弱，这种细胞自身特性的改变不因细胞传代数的增加而发生改变，可随细胞本身的传代而遗传至下一代。本细胞模型在实际应用中更贴近临床上皮肤鳞癌放疗后伤口长期不愈合的临床实际，在研究伤口放疗后不愈合的病理机制、新药物研发等方面具有重要的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体地说，是一种小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)伽马射线辐照后可长期传代细胞株及其构建方法。

背景技术

放疗是指利用放射线电离辐射(Ionizing Radiation，IR)效应杀伤肿瘤细胞的治疗方法，在头颈部恶性肿瘤治疗中占有重要地位。据文献统计，全球每年新增头颈癌病例约5492200人，超过50％的患者在治疗过程中需要接受放疗。临床上，放疗除治疗作用外，常引发的并发症是皮肤的急性损害(主要表现为皮肤红斑、干燥脱屑、毛发脱落、溃疡等)及外科手术后皮肤伤口愈合障碍。后者主要表现为局部手术伤口延迟愈合、不愈或反复破溃，增加了创伤部位感染及组织坏死的几率，最终转变为辐射性皮肤溃疡。

细胞模型的建立是研究临床疾病的基础，贴近临床实际的疾病细胞模型往往会使临床疾病的研究事半功倍，因此，建立更加符合临床实际的疾病细胞模型将更有利于临床疾病机制的研究。传统使用的伽马射线辐照模型多使用直接照射后的细胞，不对细胞进行照射后传代，这样对辐照后的细胞直接进行检测与干预，得到的只是急性辐照损伤后细胞的生理生化改变结果，这与临床实际中的慢性伤口不愈合的实际不符，因此对指导辐照后细胞长期损伤的机制研究方面的价值有限，不能更好的揭示细胞辐照的病理机制改变原因，而长期可以传代的伽马射线照射的细胞模型，尚未见有人研究报道，细胞模型的构建方法也并未有人做深入研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种伽马射线辐照后慢性不愈合伤口研究中的应用细胞株，本发明的另一目的是提供该细胞株的构建方法。

为了实现上述目的，本发明的主要技术方案是利用特定剂量的伽马射线对小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)细胞进行照射，辐照后对细胞进行正常传代，并对正常传代的细胞进行细胞增殖、凋亡、迁移等指标监测，最终建立一种伽马射线辐照后可以长期传代的细胞株的方法。

本发明的第一方面，提供一种小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)伽马射线辐照后可长期传代细胞株，其构建方法包括以下步骤：

取小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)细胞复苏后用质量浓度10％的新生牛血清(NCBS)和质量浓度1％的青霉素-链霉素双抗生素溶液的DMEM培养基培养，于37℃，5％CO₂培养箱中培养；待细胞混合程度达90％时，使用1ml含EDTA的胰酶(EDTA质量浓度为0.25％)进行消化，消化5min后，使用2ml培养液终止培养瓶内细胞消化，将培养瓶中3ml液体反复吹打均匀后，转移入15ml离心管，放置于Co60γ射线源处进行照射，照射总剂量为10Gy；辐照后的细胞拿回细胞房后平铺于培养瓶中继续培养，待细胞汇合达到80％以上可以继续进行传代，辐照后细胞按1：2比例进行传代；细胞辐照后可继续传代，第3代及其以后的细胞即为所述的可长期传代细胞株。

进一步的，所述的可长期传代细胞株是在10Gy伽马射线辐照后，细胞损伤可以稳定遗传3代或以上的细胞株。

本发明的第二方面，提供一种小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)伽马射线辐照后可长期传代细胞株的构建方法，包括以下步骤：