[发明专利]一种表达猪源唾液酸黏附素受体基因的重组载体、重组细胞及其构建方法和应用

说明书

本发明提供了一种表达猪源唾液酸黏附素受体基因的重组载体、重组细胞及其构建方法和应用，属于分子生物学技术领域，所述重组载体包括初始载体和基因Sn；所述重组细胞的宿主细胞为Marc145细胞。所述重组细胞的制备方法如下：人工合成基因Sn，并在所述基因Sn两端连接酶切位点；用Hind III限制性酶和BamH I限制性酶分别对带酶切位点的基因Sn片段以及pEGFP‑N1载体进行双酶切后，连接酶切产物获得重组载体；将所述重组载体转染所述Marc145细胞获得重组细胞。本发明所述重组细胞能够高效稳定表达基因Sn，能够应用于疫苗的制备。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种表达猪源唾液酸黏附素受体基因的重组载体、重组细胞及其构建方法和应用。

背景技术

唾液黏附素(Sialoadhesin,Sn)又被称为CD169或siglec-1，它是巨噬细胞的限制性凝集素，能与唾液酸结合。1985年Sn首次被认为是绵羊红细胞的结合受体。Sn属于免疫球蛋白超家族的成员，是I型跨膜糖蛋白，由17个重复的胞外Ig样结构域和一个短的胞质尾部组成。由于Sn的胞质尾部保守性较差且缺乏酪氨酸基序，因此推测它主要是通过受体结合唾液酸而进行细胞间的相互作用，而不是通过细胞信号而传导。目前，研究证明巨噬细胞中Sn的表达可促进病原体的相互作用，Sn能够提高唾液酸化病原体的摄取，如猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、艾滋病病毒I型(Human ImmunodeficiencyVirus-1， HIV-1)、脑膜炎奈瑟氏球菌、空肠弯曲菌和克氏锥虫等(Zhang,Q.and D.Yoo, PRRS virus receptors and their role forpathogenesis.Vet Microbiol,2015. 177(3-4):p.229-41.)。

唾液黏附素210kDa，最初被认为是猪肺泡巨噬细胞上的一种受体，它与PRRSV的唾液酸结合并相互作用，实现细胞对病毒的内吞。PK-15细胞为猪肾细胞，因不表达Sn而不感染PRRSV。研究表明，当PK-15细胞表达 Sn后，通过共定位，在细胞表面和细胞质膜内观察到I型PRRSV和II型 PRRSV在PK-15细胞的内化作用(An,T.Q.,et al.,Porcine reproductiveand respiratory syndrome virus attachment is mediated by the N-terminaldomain of the sialoadhesin receptor.Vet Microbiol,2010.143(2-4):p.371-8)。因此构建一个猪源唾液酸黏附素基因插入用Marc145细胞系具有实用性价值。

目前国内均用Marc145细胞扩大PRRSV抗原，制备疫苗。但Marc145 细胞虽可复制PRRSV，但感染周期长，病毒产量低。研究证实，用Marc145 细胞生产的PRRS疫苗免疫力低下的根本原因是细胞表面缺乏高效介导的PRRSV感染受体。现已报道的PRRSV细胞受体有硫酸乙酰肝素(HS)， CD163，唾液黏附素受体(Sn)和波形蛋白(Vimentin)等。硫酸乙酰肝素参与PRRSV早期病毒吸附，但并不能使病毒内在化形成感染，唾液酸黏附素受体既可以吸附PRRSV又可介导病毒内吞，并且这种内吞作用不依赖硫酸乙酰肝素。而在Marc145细胞上唾液黏附素受体并不表达。