[发明专利]一种快速区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的三重PCR检测引物及试剂盒

说明书

本发明公开了一种快速区分非洲猪瘟病毒野毒株与CD2V和/或360‑505R基因缺失株的三重PCR检测引物组，三对检测引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～6所示。本发明利用三对引物一次性扩增非洲猪瘟病毒CD2V、P72、360‑505R三个基因，减少了鉴定不同基因的检测成本和检测时间；且只需一次PCR反应即可扩增三个不同长度的基因，辨别毒株是否存在基因的缺失。仅需一次PCR扩增即可鉴别出三个基因，对于传统方法分别扩增检测三个基因的样本来说，成本降低了约2/3，具有广阔的市场前景。

技术领域

本发明涉及病毒株鉴别方法技术领域，更具体地，涉及一种一种快速区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的三重PCR检测引物及试剂盒。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)，可引起急性出血热，导致猪的大量发病率和死亡率事件(死亡率接近100％)。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告动物疫病,我国将其列为一类动物疫病。从2018年第一例非洲猪瘟在我国爆发来，非洲猪瘟对我国养猪业造成重大的损失，严重影响我国的养猪业的健康发展。国内外研究表明非洲猪瘟病毒CD2V和360-505R基因敲除后，可以显著降低病毒毒性，敲除这两个基因的非洲猪瘟活病毒有望成为疫苗。

非洲猪瘟病毒属于DNA病毒目，非洲猪瘟病毒科,非洲猪瘟病毒属成员，是一种具有20面体结构，直径为175～215nm，基因组全长170～190kb，含有151个开放阅读框，可编码150～200种蛋白，具有囊膜的双股线性DNA病毒。

近年来，国内外学者对其建立了荧光抗体试验、普通PCR诊断，SYBRGreen实时荧光定量PCR等技术进行ASF的检测。普通PCR方法成本较低，操作方便，得到了广泛应用。在PCR方法检测非洲猪瘟病毒CD2V和360-505R基因缺失毒株的时候，通过扩增特征性P72基因来确定是否有非洲猪瘟病毒感染，然后再分别通过扩增CD2V和360-505R基因来进一步确定是否基因缺失。存在步骤繁琐，不利于快速鉴定。多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。是一种快速准确的检测方法。

发明内容

本发明第一方面的目的在于提供一种快速区分非洲猪瘟病毒野毒株与CD2V和/或360-505R基因缺失株的三重PCR检测引物组。

本发明第二方面的目的在于提供包含上述检测引物组的试剂盒。

本发明第三方面的目的在于提供一种非疾病诊断目的的非洲猪瘟病毒野毒株与CD2V和/或360-505R基因缺失株的快速区分方法。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一种快速区分非洲猪瘟病毒野毒株与CD2V和/或360-505R基因缺失株的三重PCR检测引物组，所述检测引物的核苷酸序列如下所示：

ASFV-P72-F：5’AACCAGTGGCCCTCTCCTAT 3’(SEQ ID NO：1)；

ASFV-P72-R：5’AATCGCATTGCCTCCGTAGT 3’(SEQ ID NO：2)；

ASFV-CD2V-F：5’TCCTAAGCCTTACAGTCGTTATCAGT 3’(SEQ ID NO：3)；

ASFV-CD2V-R：5’AGATAATGGCGGGATATTGGGTAGT 3’(SEQ ID NO：4)；

ASFV-360-505R-F：5’TCTTGTCCTTTTCATACGCCTCAT 3’(SEQ ID NO：5)；