[发明专利]一种鸡传染性支气管炎病毒NNA株的电化学检测方法

说明书

本发明属于分析化学技术领域，涉及一种鸡传染性支气管炎病毒NNA株的电化学检测方法及应用。本发明通过退火、S1核酸酶(S1)酶切和高温加热方式将鸡传染性支气管炎病毒NNA株的RNA等量转换为能够专一性识别NNA株RNA的DNA即NNA‑target，基于自组装的方式将巯基修饰的核酸探针2固定于金电极表面与H120‑target孵育，引入可与NNA‑target特异结合的核酸探针1修饰的金纳米颗粒以吸附电信号分子六氨合钌(RuHex)用于产生并进行信号放大，最后利用线性伏安法对吸附的RuHex进行电化学检测，通过绘制H120株浓度与电信号之间的标准关系曲线得到线性方程，依据检测所得电信号大小计算实际样品中H120毒株的含量。该方法具有成本低、灵敏性高、特异性强的优点。

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，涉及一种用于检测鸡传染性支气管炎病毒NNA株的电化学方法。

背景技术

鸡传染性支气管炎是由冠状病毒属鸡传染性支气管炎病毒(InfectiousBronchitis Virus，IBV)引起的一种急性、高度接触性传染病，在世界范围内对养鸡业造成巨大经济损失。IBV是单股病毒，该病毒基因可因点突变和重组而发生变异。IBV血清型较多，不同血清型之间无交叉反应或交叉反应很小，增加了免疫预防难度。因此，建立一种有效的方法对IBV的不同毒株进行检测以辅助选择合适疫苗有十分重要实际意义。

纳米技术成为当今材料研究领域的热点，金纳米颗粒是金属纳米粒子中最稳定的纳米粒子之一，其具有良好的稳定性、小尺寸效应、表面效应、光学效应和良好的生物相容性等特点。基于金与巯基的自组装，金纳米颗粒与巯基修饰的特定DNA序列形成探针，或通过巯基在金表面自组装制备DNA修饰电极，在生物医药、基因治疗以及临床检验等研究领域均有重要作用。

现今检测病毒常用的方法有免疫沉淀、荧光定量PCR法、酶联免疫法等。这些检测方法往往需要昂贵的仪器，或需要对催化底物进行放射性标记或酶标记。众所周知，一些动物实验是非常耗时且昂贵，甚至可能危害动物生命健康。电化学方法具有的设备简单，价格低廉、灵敏度高、特异性好、有效等优点。

发明内容

本发明的目的是结合核酸修饰的金纳米颗粒，发挥电化学检测技术优势，建立一种有效而又具有极高灵敏度的鸡传染性支气管炎病毒NNA株的电化学检测方法。

本发明的技术方案：本发明是一种鸡传染性支气管炎病毒NNA株的电化学检测方法。本发明通过退火、S1核酸酶(S1)酶切和高温加热方式将鸡传染性支气管炎病毒NNA株的RNA等量转换为能够专一性识别NNA株RNA的DNA即NNA-target，基于自组装的方式将巯基修饰的核酸探针2固定于金电极表面与NNA-target孵育，引入可与NNA-target特异结合的核酸探针1修饰的金纳米颗粒以吸附电信号分子六氨合钌(RuHex)用于产生并进行信号放大，最后利用线性伏安法对吸附的RuHex进行电化学检测，通过绘制NNA株浓度与电信号之间的标准关系曲线得到线性方程，依据检测所得电信号大小计算实际样品中NNA毒株的含量。

方法包括以下步骤：AuNPs的制备、探针1修饰AuNPs的制备、金电极的预处理、探针2修饰金电极的制备、金电极与样品杂交、金电极与AuNPs共孵育和电化学检测。

(1)AuNPs的制备

制备前所有玻璃器皿须在新配置王水(HNO₃∶HCl＝3∶1)中浸泡30min，大量的双蒸水冲洗后烘干备用。AuNPs的制备过程如下：将100mL 0.01％的氯金酸溶液加入三颈烧瓶中搅拌加热至沸腾。待其煮沸后，迅速加入3.5mL 1％的柠檬酸三钠，继续加热搅拌15min后待溶液变成酒红色关闭加热器，继续搅拌30min后，关闭搅拌器，待溶液冷却至室温后将制备好的AuNPs存放于棕色试剂瓶中4℃保存。

(2)探针1修饰AuNPs的制备