[发明专利]一种基于丝网印刷电极的NF-κB电化学检测方法

说明书

本发明属于分析化学技术领域，涉及一种基于丝网印刷电极的NF‑κB电化学检测方法。本发明主要是利用肽核酸(PNA)能够竞争性的结合含NF‑κB结合序列dsDNA中的互补ssDNA形成稳定的PNA‑DNA杂交链，NF‑κB的存在会抑制PNA‑DNA杂交链生成的原理。实验首先在激活的丝网印刷电极表面镀金并共价修饰PNA，PNA竞争性的结合含NF‑κB结合序列dsDNA中的互补ssDNA在电极表面形成稳定的PNA‑DNA杂交链，NF‑κB的存在会与dsDNA结合并抑制PNA‑DNA杂交链的形成且NF‑κB含量的差别会导致PNA‑DNA杂交链形成量不同，选取特异性嵌合于PNA‑DNA杂交链中MB作为电信号分子，利用差分脉冲伏安法测量NF‑κB不同浓度时MB的峰电流值，绘制NF‑κB浓度与峰电流值的关系曲线得出线性方程，通过检测电信号计算待测样品中NF‑κB含量。该方法灵敏度高，为NF‑κB的检测提供新思路。

技术领域

本发明涉及一种基于丝网印刷电极的NF-κB电化学检测方法，属于分析化学领域。

背景技术

核转录因子NF-κB是隶属于锌指结构家族的转录因子，能与B细胞免疫球蛋白κ轻链启动子区域相结合，并且调控该区域基因启动表达的蛋白。NF-κB广泛存在于哺乳动物的各个细胞类型中，不同类型研究皆发现机体在健康状态和病理状态下NF-κB的表达量有明显的差异，NF-κB的含量的变化在机体免疫、代谢、炎症反应、肿瘤发展以及其他病程的发生发展过程中发挥重要的指示作用，对于疾病的发展、早期诊断或预防，建立一种灵敏、快速、便捷检测NF-κB水平的方法是非常必要的。

现今，NF-κB的检测方法包括电泳迁移率变动分析，蛋白质免疫印迹等。然而，这些方法通常需要特异性抗体，繁琐的标记或特殊仪器。众所周知，标记过程往往是非常耗时且昂贵，甚至可能会导致生物分子的变性。电化学检测技术具有设备简单，价格低廉、灵敏度高、简便快捷，同时可以实现无标记检测等优点。其中丝网印刷电极作为一种小型传感器具有多种优势，缩短反应时间，平行性好，灵敏度更高。在电化学实验中得到广泛的应用，近年来，被成功的应用于生物大分子定性或定量的检测。

发明内容

本发明的目的是发挥电化学检测技术的优势，建立一种简单、无需标记且成本低廉，同时又具有高灵敏度的NF-κB检测方法。

本发明的技术方案：一种基于丝网印刷电极的NF-κB电化学检测方法，利用PNA与DNA结合具有高亲和力与特异性，能够竞争性的结合dsDNA中的互补ssDNA形成稳定的PNA-DNA杂交链；MB能够嵌合于杂交双链，作为氧化还原指示剂放大电信号响应；设计了含有NF-κB结合序列的DNA，当NF-κB蛋白存在时，NF-κB蛋白与dsDNA的靶向结合能抑制PNA-DNA杂交链的生成，电极表面修饰的PNA单链与MB互作力不强，信号微弱；NF-κB含量的差别导致不同程度的信号响应，测得标准曲线，通过统计学分析得出NF-κB检测的线性方程并计算其含量。该方法具有良好的重复性，高的灵敏度，可应用于NF-κB的检测。

方法包括以下步骤：丝网印刷电极的预处理、金粒子修饰丝网印刷电极、PNA修饰镀金丝网印刷电极、样品与修饰电极共孵育、MB与修饰电极共孵育、NF-κB的电化学检测。

(1)丝网印刷电极的预处理

具体步骤如下：用蒸馏水冲洗丝网印刷电极表面10s，洗耳球吹干。之后将处理好的电极置于0.1M PBS中，在0V-0.8V电压范围内进行循环伏安扫描，扫速参数设置为0.1V/s，直至达到稳定后，室温干燥。

(2)金粒子修饰丝网印刷电极

将上述(1)中经过经典方法预处理的丝网印刷电极表面滴加100μL 5mM的氯金酸溶液(0.5M H₂SO₄)中电沉积350s，沉积电位为-200mV。

(3)PNA修饰镀金丝网印刷电极