[发明专利]用于植物基因编辑的成套载体及其应用

说明书

本发明公开了用于植物基因编辑的成套载体及其应用。本发明首先公开了用于植物基因编辑的成套载体，包含植物双元表达载体和致毒辅助载体。本发明进一步公开了上述成套载体在植物遗传转化或植物基因组编辑中的应用。本发明开发的成套载体，通过与形态建成调控(MR)基因整合，显著提高农杆菌介导的玉米转化效率，大大提高了玉米基因组编辑的通量。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及用于植物基因编辑的成套载体及其应用。

背景技术

自2013年以来出现的CRISPR/Cas基因编辑技术为作物品种改良带来了前所未有的新机遇。能否有效递送CRISPR/Cas试剂到植物细胞是其成功应用的关键，缺乏合适的CRISPR/Cas递送方法是其在很多植物中高效应用的主要障碍。递送方法包括间接法和直接法，前者使用农杆菌或病毒介导，后者使用原生质体转染或基因枪轰击。在植物中，农杆菌介导的遗传转化是目前CRISPR/Cas递送是最流行的方法，占比已经报告的编辑事件的80％以上，其应用范围涵盖几乎所有的模式植物、主要的大田作物及果蔬作物。

农杆菌介导遗传转化的缺点是目前的常规方法仅适用于有限的植物种类，且严重依赖基因型，在单子叶植物中尤其如此(Altpeter，F.，Springer，N.M.，Bartley，L.E.，Blechl，A.E.，Brutnell，T.P.，Citovsky，V.，Conrad，L.J.，Gelvin，S.B.，Jackson，D.P.，Kausch，A.P.，Lemaux，P.G.，Medford，J.I.，Orozco-Cardenas，M.L.，Tricoli，D.M.，VanEck，J.，Voytas，D.F.，Walbot，V.，Wang，K.，Zhang，Z.J.，and Stewart，C.N.，Jr(2016).Advancing Crop Transformation in the Era of Genome Editing.Plant Cell28.1510-1520.)。

因此，需要开发出一种能显著提高农杆菌介导的转化效率的方法，以提高CRISPR/Cas9基因组编辑效率。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何提高农杆菌介导的玉米转化效率，以提高玉米CRISPR/Cas9基因组编辑的通量。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了用于植物基因编辑的成套载体。

本发明用于植物基因编辑的成套载体由植物双元表达载体和致毒辅助载体组成；

其中，所述植物双元表达载体包含T-DNA；所述T-DNA包括Cas9基因表达框(表达盒)、两个同向的Cre或Flp重组酶特异识别位点loxP-Frt(所述loxP-Frt代表loxP基因与Frt基因连接在一起形成的loxP-Frt)和位于所述loxP-Frt之间的所述Cre或Flp重组酶表达框(表达盒)和MR基因表达框(表达盒)；所述MR基因的序列为序列1的第12111位～第15977位。

所述致毒辅助载体(农杆菌vir基因表达载体)包含农杆菌致毒基因簇。

在本发明中一个实施例中，所述vir基因克隆自农杆菌EHA105的Ti质粒，所述vir基因的序列为GenBank No.DQ058764(更新日期为2016年7月26日)的第150641～第176559位。

上述成套载体中，所述植物双元表达载体的T-DNA还包括sgRNA基因表达框(表达盒)。具体的，所述sgRNA基因表达框位于Cas9基因表达框的上游。

上述成套载体中，所述表达框(表达盒)是指能够在宿主细胞中表达相应基因的DNA，该DNA不但可包括启动相应基因转录的启动子，还可包括终止相应基因转录的终止子。进一步，所述表达框(表达盒)还可包括增强子序列。