[发明专利]精确大片段基因删除结合终止密码子插入的基因敲除法

权利要求书

1.一种精确大片段基因删除结合终止密码子插入的基因敲除法，其特征在于，包括以下步骤：

准备Cas9质粒、共编辑标记质粒、报告基因质粒和雌雄同体线虫；

确定5’和3’端sgRNA靶位点序列；

确定和构建修复模板；

构建5’端上游sgRNA质粒和3’端下游sgRNA质粒；

配制显微注射DNA混合液：将所述5’端上游sgRNA质粒和3’端下游sgRNA质粒、所述Cas9质粒、共编辑标记质粒、报告基因质粒和修复模板混合得到所述显微注射DNA混合液；

显微注射：将所述显微注射DNA混合液注射入雌雄同体线虫的性腺，得到P0代线虫，培养得到F1代线虫；以及

筛选、验证目的突变。

2.根据权利要求1所述的基因敲除法，其特征在于，所述确定的5’和3’端sgRNA靶位点序列包括以下步骤：

从sgRNA效率预测网站上查找起始密码子附近100bp以内的sgRNA靶位点；选择编辑效率特异性分数高并且脱靶效应低的sgRNA靶位点，即得到所述5’端sgRNA靶位点序列；

从sgRNA效率预测网站上查找在5’端sgRNA靶位点序列与终止密码子之间编辑效率特异性分数高并且脱靶效应低的sgRNA靶位点；即得到所述3’端sgRNA靶位点序列。

3.根据权利要求1所述的基因敲除法，其特征在于，精确大片段基因删除序列的5’和3’端点分别位于5’sgRNA靶序列和3’sgRNA靶序列中。

4.根据权利要求1所述的基因敲除法，其特征在于，所述修复模板为寡核苷酸链。

5.根据权利要求4所述的基因敲除法，其特征在于，所述修复模板包含终止密码子。

6.根据权利要求4所述的基因敲除法，其特征在于，所述修复模板上的终止密码子两侧分别包含精确大片段基因删除序列外5’上游和3’下游35-50bp的序列。

7.根据权利要求1所述的基因敲除法，其特征在于，所述显微注射DNA混合液体系包括以下：

Cas9质粒，50ng/μL；

共编辑标记质粒，50ng/μL；

5’端上游sgRNA质粒，50ng/μL；

3’端下游sgRNA质粒，50ng/μL；

报告基因质粒，20ng/μL；和

修复模板，20ng/μL。