[发明专利]一种利用基因工程获得重组人纤连蛋白的方法

说明书

本发明属于基因工程领域，更具体地公开了一种密码子优化的重组纤连蛋白基因，通过基因工程的方法在体外进行表达纯化。本发明提供的利用毕赤酵母作为表达宿主细胞，可以解决人工提取纤连蛋白量少并且生物活性低的技术缺陷。

技术领域

本发明属于基因工程领域，更具体地公开了一种密码子优化的重组纤连蛋白基因，通过基因工程的方法在体外进行表达纯化。

背景技术

纤连蛋白(Fibronectin)，缩写为FN，是一种高分子量(220-250KD)胞外基质的糖蛋白，它通常是由两个亚基通过C末端的二硫键交联形成。主要包括三种类型，其中Ⅰ型和Ⅱ型主要通过二硫键进行稳定，Ⅲ型纤连蛋白缺乏二硫键，因此可在外力作用下使部分两个反向β-折叠施展。纤连蛋白不同的亚单位来自于同一基因的表达产物，基因转录后形成的mRNA可被不同的酶剪切，导致形成不同的纤连蛋白多肽。纤连蛋白的每个亚单位包含数个结构域，可与细胞表面受体、胶原、纤维蛋白以及硫酸蛋白多糖的亲和部位结合。RGD(Arg-Gly-Asp)三肽序列是细胞识别的最小亚单位。

纤连蛋白广泛参与细胞迁移、粘附、增殖、止血及组织修复等过程，调动单核吞噬细胞系统清除损伤组织处有害物质，具有生长因子样作用。纤连蛋白作为细胞培养的基质，可提高多种细胞的贴壁率、汇合率，缩短细胞汇合时间，使细胞形态结构良好，代谢率增强，DNA、RNA及蛋白质合成速度显著提高。将纤连蛋白涂到微球载体上作为细胞大量生产的介质，可以节省空间、原料，成为应用规模细胞培养技术生产新药品的基础物质。

目前国内研究使用的FN多购买于国外，或者从人体或动物血液和组织中提取的天然纤连蛋白，但这些方法获得的纤连蛋白数量有限且成本昂贵。另一方面，野生型FN分子量太大，基本无法重组表达。外源蛋白质表达是一项很复杂的工作，特定蛋白可否在大肠杆菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞、植物表达系统中按需要表达、是否具有活性都是无法预知的(张小霞等，外源蛋白质表达系统类型的研究进展，国外医学卫生学分册，2004年，第31卷，第4期，pp203-208)。

发明内容

为了解决现有技术中人工提取纤连蛋白量少并且生物活性低的技术缺陷，本发明人经过深入研究，选取特定的人纤连蛋白功能性片段，利用毕赤酵母表达系统，表达密码子优化的重组纤连蛋白，从而既可以解决大量生产的问题，同时也降低了成本，为纤连蛋白在医学和美容方面的应用提供了基础。

因此，本发明提供以下各项：

1.一种重组纤连蛋白，其包括如下氨基酸序列：

MHHHHHHNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELRGSEGSEGEGGSEGSEGEGGSEGSEGEGGSEGSEGEGGSEGSEGEGGSEGSEGEGITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTEIDKP(SEQ ID NO:1)。野生型FN分子量太大，基本无法表达。本发明的上述氨基酸序列为发明人特别选取的纤连蛋白的功能性片段(即具有纤连蛋白生物学活性的片段)，不仅能够在酵母中大量重组表达，而且获得了活性重组FN蛋白，解决了现有技术中人工提取纤连蛋白量少并且生物活性低的技术问题。

2.根据以上1所述的重组纤连蛋白，其还包括Kex2蛋白酶序列、分泌信号肽序列、用于蛋白纯化的His标签、或它们的组合；和/或所述重组纤连蛋白具有选自以下的生物活性：促进细胞黏附、促进细胞增殖和促进伤口愈合。

3.编码根据以上1或2所述的重组纤连蛋白的核酸，其具有酵母偏好密码子优化的核苷酸序列，优选其核苷酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示，更优选其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.根据以上3所述的核酸，其还包括编码Kex2蛋白酶序列、分泌信号肽序列、用于蛋白纯化的His标签、或它们的组合的核苷酸序列。