[发明专利]一种检测蛋白磷酸化和乙酰氨基葡萄糖化关联作用的方法

说明书

本发明公开了一种检测蛋白磷酸化和乙酰氨基葡萄糖化关联作用的方法，所述方法包括以下步骤：将胰蛋白酶处理得到的多肽样品平均分配成三等分，第一个等分用磷酸酶处理，用IBT‑10Plex116C标记；第二个等分用O‑乙酰葡萄糖胺水解酶处理，用IBT‑10Plex117N标记；第三等分无特殊处理，用IBT‑10Plex118N标记；样品混合，与氢氧化钡、一个含有生物素和巯基的双官能团化合物反应，通过链霉亲和素蛋白‑磁珠从混合物中被亲和富集；用紫外光光照除去含巯基化合物的其他结构，得到多肽衍生物用于质谱分析。本发明可以找出整个蛋白质组中同时具有磷酸化和O‑GlcNAcylation的Ser/Thr位点，为有氧糖酵解和信号转导通道之间的关系提供了具体数据，促进癌细胞特定生物标志物的发现，用于肿瘤的早期诊断以及治疗药物新靶点。

技术领域

本发明涉及合成化学、质谱分析、生物技术领域，具体为一种检测蛋白磷酸化和乙酰氨基葡萄糖化关联作用的方法。

背景技术

癌细胞通常依靠有氧糖酵解(aerobic glycolysis)来提供能量和快速增长所需要的构件分子(氨基酸，核苷酸等)。每个葡萄糖分子所产生的三磷酸腺苷(ATP)在这种不寻常的代谢途径中比在正常细胞中的氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)要少得多。因此，为满足快速生长的需求，癌细胞的葡萄糖摄取率高，有氧糖酵解活跃。这种现象，称为瓦伯格效应(Warburg Effect)，是与肿瘤的进展密切相关的。因此，针对肿瘤的高葡萄糖需求是一种很有希望的诊断和治疗方法。例如，有氧糖酵解的一种抑制剂，2-脱氧葡萄糖，目前在临床试验中治疗前列腺癌。另一种葡萄糖相似物，18F-葡萄糖，在正电子发射断层扫描(PET)中广泛应用于肿瘤图像显示。

瓦伯格效应如何促进癌细胞的代谢和繁殖的具体机制仍然缺乏明确的理论。因为通常情况下，2-5％由细胞摄入的葡萄糖进入氨基己醣生物合成途径，产生了一种高能核苷糖分子，乙酰氨基葡萄糖尿苷二磷酸(uridine diphosphate N-acetylglucosamine,UDP-GlcNAc)。瓦伯格效应的一个后果是癌细胞中产生高水平的乙酰氨基葡萄糖尿苷二磷酸。这是一种非常常见的蛋白质翻译后修饰的前体分子，也就是在丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)上的N-乙酰氨基葡萄糖化(O-GlcNAcylation)。高浓度的葡萄糖通过瓦伯格效应进入癌细胞，从而调节细胞内O-GlcNAc的水平。

由于蛋白质中的Ser/Thr同时也是另外一种普遍的蛋白质翻译后修饰磷酸化的位点，O-GlcNAcylation必然会影响到相应位点上的磷酸化。众多的研究已经表明蛋白磷酸化是刺激肿瘤生长和转移的一个重要途径，因此，蛋白O-GlcNAcylation能够通过和磷酸化的关联作用，将有氧糖酵解与肿瘤进展相关的细胞信号通路联系起来(Comer and Hart2000；Hart et al.2011)。例如，内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)中的Ser1177就可以同时被磷酸化和O-GlcNAcylation。当O-GlcNAcylation增加时，Ser1177的磷酸化减少，内皮型一氧化氮合成酶的活性也相应减小。

发明内容

本项发明公开了一种新型定量蛋白质组学工具，用于探索癌细胞中蛋白磷酸化和O-GlcNAcylation之间的关联作用。本发明可以找出整个蛋白质组中同时具有磷酸化和O-GlcNAcylation的Ser/Thr位点，给理解有氧糖酵解和信号转导通道之间的关系提供了具体数据，从而可以促进癌细胞特定生物标志物的发现，用于肿瘤的早期诊断以及治疗药物新靶点。

为了达到以上目的，本发明提供如下技术方案：

一种用IBT(Isobaric Tag)技术确定蛋白磷酸化和O-GlcNAcylation的关联作用的定量蛋白质组学方法，所述方法包括以下步骤：

1)将胰蛋白酶处理得到的多肽样品平均分配成三等分，将三等分分别进行以下处理：第一个等分用磷酸酶处理；第二个等分用O-乙酰葡萄糖胺水解酶处理；第三等分无特殊处理；