[发明专利]一种针对II类VII型流行NDV株DHN3的感染性重组克隆方法有效

专利信息
申请号: 201910894754.9 申请日: 2019-09-20
公开(公告)号: CN110592108B 公开(公告)日: 2021-03-26
发明(设计)人: 陈瑞爱;黄梅;王楠楠;李延鹏;刘定祥;叶俊贤;罗琼;杨小云;董楠 申请(专利权)人: 华农(肇庆)生物产业技术研究院有限公司
主分类号: C12N15/45 分类号: C12N15/45;C12N15/85;C12N15/66;C12N7/01
代理公司: 广州市科丰知识产权代理事务所(普通合伙) 44467 代理人: 龚元元
地址: 526060 广东省肇庆市高新区创业路5*** 国省代码: 广东;44
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摘要:
搜索关键词: 一种 针对 ii vii 流行 ndv dhn3 感染性 重组 克隆 方法
【权利要求书】:

1.一种针对II类VII型流行NDV株DHN3的重组克隆方法,其特征在于,包括如下步骤:

步骤1:构建辅助质粒pXJ40-NP、pXJ40-P和pXJ40-L,辅助质粒pXJ40-NP、pXJ40-P和pXJ40-L的目标片段分别为NP基因、P基因、L基因,载体为pXJ40;

步骤2:构建全基因组表达载体pBR322-DHN3:将人工重组得到的DHN3全基因组重组入pBR322质粒中得到全基因组表达载体pBR322-DHN3;所述DHN3全基因组为II类VII型鸡新城疫病毒的全基因组;DHN3全基因组的序列如序列表SEQ ID NO 1;

步骤3:将辅助质粒pXJ40-NP、pXJ40-P和pXJ40-L、全基因组表达载体pBR322-DHN3共转染BHK-21细胞,得到含重组病毒rDHN3的病毒液;

其中,所述步骤2具体为:

步骤21:建立pBR322-Base载体:在pBR322质粒上引入能够与DHN3全基因组进行同源重组的片段;所述片段上具有与DHN3全基因组的3’末端和5’末端对应的同源臂;

步骤22:构建过渡载体:所述过渡载体为质粒pBR322-PNP、质粒pBR322-PDP、质粒pBR322-LPD3;

从5’端到3’端,所述质粒pBR322-PNP的目的片段的序列为NP、MINI和P基因序列;从5’端到3’端,所述质粒pBR322-PDP的目的片段序列为P、PD1、PD2和PD3基因序列;从5’端到3’端,质粒pBR322-LPD3的目的片段序列为PD3、L1、L2、L3和L4基因序列;

质粒pBR322-PNP、质粒pBR322-PDP、质粒pBR322-LPD3的制备方法为:

A.制备质粒片段:将pBR322载体用HindⅢ和NheⅠ作双酶切,然后经胶回收备用,得到pBR322质粒片段;

B.制备目的基因片段,所述目的基因片段为NP、MINI、P、PD1、PD2、PD3、L1、L2、L3和L4基因;

C.将pBR322质粒片段目的基因片段和对应的目的基因片段用重组酶连接,经细菌转化,单菌落PCR初选,扩增质粒DNA,酶切质粒DNA后跑DNA胶复选,最后测序验证,得到质粒pBR322-PNP、质粒pBR322-PDP、质粒pBR322-LPD3;

步骤23:构建DHN3全基因组DHN3-A:将质粒pBR322-PDP、质粒pBR322-LPD3分别用BtgZⅠ单酶切后回收基因片段PDP和LPD3;载体pBR322-PNP用BtgZⅠ和HindⅢ双酶切回收基因片段PNP;将基因片段PNP、基因片段PDP、基因片段LPD3通过T4连接酶作体外连接,获得DHN3全基因组DHN3-A;

步骤24:构建带同源臂的质粒片段:将步骤21中的pBR322-Base载体作为模板进行PCR扩增得到带同源臂的质粒片段;

步骤25:构建全基因组表达载体pBR322-DHN3:将步骤24中的带同源臂的质粒片段和步骤23中的DHN3全基因组DHN3-A进行同源重组得到具有DHN3全基因组DHN3-A的质粒pBR322-DHN3;

其中,NP基因在序列表SEQ ID NO:1中位置为1-1591nt;P基因在序列表SEQ ID NO:1中位置为1925-3109nt;L基因在序列表SEQ ID NO:1中位置为8166-15192nt;MINI基因在序列表SEQ ID NO:1中位置为1414-1949nt;PD1基因在序列表SEQ ID NO:1中位置为2935-4956nt;PD2基因在序列表SEQ ID NO:1中位置为4838-6454nt;PD3基因在序列表SEQ IDNO:1中位置为6261-8283nt;L1基因在序列表SEQ ID NO:1中位置为8166-10709nt;L2基因在序列表SEQ ID NO:1中位置为10174-12299nt;L3基因在序列表SEQ ID NO:1中位置为12238-14433nt;L4基因在序列表SEQ ID NO:1中位置14214-15192nt。

2.根据权利要求1所述针对II类VII型流行NDV株DHN3的重组克隆方法,其特征在于,所述步骤3具体为:用能表达T7RNA聚合酶的质粒与辅助质粒pXJ40-NP、pXJ40-P、pXJ40-L、全基因组表达载体pBR322-DHN3共转染BHK-21细胞;得到含重组病毒rDHN3的病毒液。

3.根据权利要求1所述针对II类VII型流行NDV株DHN3的重组克隆方法,其特征在于,所述步骤21具体为:在pBR322质粒上分别引入1个T7启动子,1个T7终止子以及1个HDVRibozyme;T7启动子下游引入DHN3的3’末端的部分碱基HC1;在HDV Ribozyme的上游引入DHN3的 5’末端部分碱基HC2;其中,碱基HC1在DHN3全基因组序列中的位置顺序为15192-15159nt;碱基HC2在DHN3全基因组序列中的位置顺序为141-1nt。

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