[发明专利]一种包载干细胞复合因子的美容及皮肤修复透明质酸钠凝胶

权利要求书

1.一种包载干细胞复合因子的美容及皮肤修复透明质酸钠凝胶，其特征在于，所述包载干细胞复合因子的美容及皮肤修复透明质酸钠凝胶由干细胞复合因子和透明质酸钠组成；按照质量体积比透明质酸钠的添加比例为干细胞复合因子溶液的0.1％～0.5％。

2.一种如权利要求1所述包载干细胞复合因子的美容及皮肤修复透明质酸钠凝胶的制备方法，其特征在于，所述包载干细胞复合因子的美容及皮肤修复透明质酸钠凝胶的制备方法包括以下步骤：

第一步，经过组织块培养法获得脐带间充质干细胞，纯化、扩大培养；收集细胞培养上清液，经过浓缩、过滤、蛋白含量测定、质检，得到干细胞复合因子溶液；

第二步，然后将干细胞复合因子溶液和透明质酸钠混合均匀，制备成包载干细胞复合因子的透明质酸钠凝胶。

3.如权利要求2所述的包载干细胞复合因子的美容及皮肤修复透明质酸钠凝胶的制备方法，其特征在于，所述干细胞复合因子的制备方法包括：

步骤一，脐带间充质干细胞的原代分离与培养；

步骤二，脐带间充质干细胞表面标志物的鉴定；

步骤三，细胞因子生产与检测。

4.如权利要求3所述的包载干细胞复合因子的美容及皮肤修复透明质酸钠凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤一具体包括：

1)将脐带组织放置在含脐带采集液的专用脐带无菌采集瓶中，密封保存；使用4℃恒温保温箱，送回无菌实验室；

2)在生物安全柜内，将脐带倒入150mm直径培养皿中，用生理盐水清洗3-5次；用长柄手术剪将脐带剪成长3-4cm的小段，用生理盐水重复清洗3-5次，去除血渍；

3)使用眼科弯剪沿静脉血管螺旋走势剪开脐带，将静脉血管去除干净，再使用带齿弯镊撕下两条动脉，用眼科镊将位于羊膜与血管之间的白色结缔组织即华通氏胶取出；用生理盐水冲洗华通氏胶，重复清洗2-3次；

4)将获得的华通氏胶用眼科弯剪将胶体剪碎，剪成1mm³大小，接种于150mm直径无菌培养皿中，组织块儿间隔约2mm，组织贴好后将培养皿小心放入培养箱中30min，随后取出，加入无血清间充质干细胞培养基，加入量铺满皿底即可；

5)组织贴壁后，第2天进行补液，以后每2～3d换液1次；

6)在倒置显微镜下观察，细胞融合达到60％后，去除组织块，用0.25％的胰酶消化，按1∶3～1∶4的比例传代，继续扩增培养。

5.如权利要求3所述的包载干细胞复合因子的美容及皮肤修复透明质酸钠凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤具体包括：

1)取P5代以内细胞，胰酶消化计数后，按1×10⁵-1×10⁶/管的密度接种至7个1.5ml EP管中，每管加入1ml PBS，混匀细胞悬液，1000rpm/min，离心5min；离心完毕后，弃掉上清，每管加入100μl的PBS重悬细胞，并在避光条件下分别加入以下流式抗体5μl：PE Anti-HumanHLA-DR、PE anti-human CD105、FITC Anti-Human CD90、FITC anti-human CD34、FITCanti-human CD45、FITC Anti-Human 29；

2)抗体加入后用200μl微量移液器混匀，4℃避光孵育30min；

3)孵育结束后，用PBS洗涤细胞两次，每次用1ml；1000rpm/min，离心5min；离心后用500μl PBS重悬细胞后上流式仪检测。