[发明专利]免标记高速显微成像方法及装置

说明书

本发明公开了一种免标记高速显微成像方法及装置，其中，方法包括：利用超短脉冲激光光源生成超短脉冲激光；将超短脉冲激光的光束转换成具有扩展轴向焦深的贝塞尔光束，并利用该贝赛尔光束激发样品，并通过非线性光学效应在样品内沿第一预设方向产生具有轴向焦深的谐波信号；控制贝塞尔光束在第二预设方向以预设的横向扫描偏转角进行往复运动，并控制样品以预设的速度沿第三预设方向进行纵向移动，以使得贝塞尔光束在样品平面上进行扫描，激发样品产生谐波信号；根据谐波信号进行数据重建，获得免标记高速高通量谐波显微图像。该方法可以显著提高成像速度及数据通量，并可以用于病理切片等生物样品的快速成像，具有广阔的生物医学应用前景。

技术领域

本发明涉及光学显微技术领域，特别涉及一种免标记高速显微成像方法及装置。

背景技术

生物样品的三维成像在诸多生物医学研究中有着重要应用。病理活检作为临床检查的常规手段，在临床诊断中有重要地位。目前在病理活检中通常采用传统的苏木精—伊红染色法(HE染色法)对活检切片进行染色，作为病理检测的“金标准”。但是HE染色法需要将样品经过固定、脱水、浸蜡、脱蜡、切片、染色等复杂的预处理过程后，再置于显微镜下进行观察、成像，无法实现实时观测与诊断。为了提高病理检测的效率，在病理组织成像中免除上述复杂的预处理过程，急需发展免标记的显微成像方法。

近年来，随着非线性光学的发展，人们提出了基于生物组织固有的光物理特性产生的二次谐波(second harmonic generation)信号、三次谐波(third harmonicgeneration)信号进行免标记显微成像的方法。例如，对于具有非中心反演对称结构的样品，可获得较强的二次谐波产生信号；在样品中的结构边界处，可获得较强的三次谐波信号。基于谐波产生效应的显微成像技术由于采用长波长(近红外光)激发，可在一定程度上克服生物组织散射的影响，提高成像深度。基于上述非线性光学效应的显微成像技术具有三维层析的优点，然而，这种三维层析能力使得样品图像的获取需要进行扫描成像：通常情况下，采用驱动振镜组进行二维横向扫描；采用轴向移动物镜或放置样品的载物台的方式进行轴向扫描。考虑到上述机械元件固有的惯性，扫描成像的速度将受到制约，限制了成像通量。同时，大病理切片的成像通常存在着样品放置倾斜造成的离焦问题。在有限景深的条件下，现有轴向层析成像技术需要扩大扫描体积以获得完整的病理切片三维信息，延长了成像时间，影响了成像速度。

另一方面，由于病理切片的尺寸通常大于所用显微镜的视场大小，欲实现完整切片的成像，通常需要先在小区域(如显微镜限定的视场)内进行扫描成像，再通过频繁地移动样品进行成像，然后进行视场拼接。样品的横向移动通常具有较慢的响应速度，浪费了大量时间，进一步降低了病理切片的成像速度及数据通量。

综上，实现高速、高通量显微成像是免标记显微成像领域亟需克服的技术难点。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

为此，本发明的一个目的在于提出一种免标记高速显微成像方法，该方法可以显著提高成像速度及数据通量，并可以用于病理切片等生物样品的快速成像，具有广阔的生物医学应用前景。

本发明的另一个目的在于提出一种免标记高速显微成像装置。

为达到上述目的，本发明一方面实施例提出了一种免标记高速显微成像方法，包括以下步骤：利用超短脉冲激光光源生成超短脉冲激光；利用锥透镜、会聚透镜、中继透镜组和物镜，将所述超短脉冲激光的光束转换成具有扩展轴向焦深的贝塞尔光束；利用具有扩展轴向焦深的贝赛尔光束激发样品，并通过非线性光学效应在所述样品内沿第一预设方向产生具有轴向焦深的谐波信号；利用扫描振镜控制所述贝塞尔光束在第二预设方向以预设的横向扫描偏转角进行往复运动，并利用位移台控制所述样品以预设的速度沿第三预设方向进行纵向移动，以使得所述贝塞尔光束在样品平面上进行扫描，激发所述样品产生谐波信号；根据所述谐波信号进行数据重建，获得免标记高速高通量谐波显微图像。