[发明专利]基于ARTP复合诱变技术的高通量筛选庆大霉素高产菌株的方法

说明书

本发明涉及基于ARTP复合诱变技术的高通量筛选庆大霉素高产菌株的方法，包括孢子悬浮液制备、ARTP诱变复合诱变、快速检测产物、初筛庆大霉素高产菌株和复筛获得高产菌株保藏以及高产菌株稳定性考察的步骤。与现有技术相比，本发明利用OPA与庆大霉素发生反应形成在330nm左右形成特征吸收峰的原理，通过酶标仪实现快速测定OD值从而成功实现了庆大霉素快速检测。克服了常规采用磷钨酸法与庆大霉素形成的沉淀导致OD值下降的方法存在的专一性较差，发酵液颜色等干扰问题。本发明具有快速、高通量、操作便捷、准确等特点，很大程度上提高了庆大霉素诱变育种、筛选效率，使获得庆大霉素高产菌株的几率大大提高。

技术领域

本发明属于微生物培养技术领域，尤其是涉及一种基于ARTP复合诱变技术的高通量筛选庆大霉素高产菌株的方法。

背景技术

庆大霉素是由小单胞菌(绛红小单胞菌或棘孢小单胞菌)经发酵提取产生的一种氨基糖苷类抗生素，可以抑制细菌的蛋白质的生物合成，从而起到抑杀细菌的作用，对革兰氏阴性菌和部分革兰氏阳性菌有强效的杀菌作用。庆大霉素是主要的氨基糖苷类抗菌素，其市场占到氨基糖苷类抗菌素的50％。因此，开发针对庆大霉素工业生产菌株的高通量筛选诱变获取高产菌株，对实际应用有着重要意义。

实际企业生产庆大霉素的绛红小单胞菌或棘孢小单胞菌株大多由传统的筛选方法获得，摇瓶培养，液相或生物法检测效价，存在投资高，筛选周期长，筛选通量小，筛选方法单一，筛选效率低下等缺点，因此庆大霉素的生产能力提高幅度较低。现有技术中并未形成整套的可以大规模高通量诱变筛选生产庆大霉素菌株的方法。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种基于ARTP复合诱变技术的高通量筛选庆大霉素高产菌株的方法。

本发明的方法可以帮助生产企业快速获取能够应用于实际生产的高产菌株。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种基于ARTP复合诱变技术的高通量筛选庆大霉素高产菌株的方法，包括以下步骤：

第一步，孢子悬浮液制备：将成熟的工业生产菌株斜面上孢子或甘油管保藏的孢子接种于双碟培养基内，待孢子成熟后，取培养基上成熟的孢子转移至装有无菌生理盐水的离心管中制备孢子悬浮液，根据孢子量稀释不同梯度；

第二步，ARTP诱变复合诱变：将不同梯度的孢子悬浮液加入诱变剂后，使用ARTP诱变仪产生的等离子流处理不同时间进行诱变，诱变完成后立即涂布于双碟培养基内，待孢子成熟后，将待筛选的工业生产菌株单菌落分别接种于装有斜面培养基和发酵培养基的深孔板中培养；

第三步，快速检测产物：微孔板发酵培养4-5天后对发酵液调节pH至1.4-1.5，常温放置后离心，取上清加入OPA衍生剂，加水，然后水浴，待冷至常温后放置于孔板离心机上离心，取上清液转移到酶标板上，然后设定酶标仪在325nm下测定各发酵液的吸光度，根据标准曲线计算对应产物含量获得高产菌株；

第四步：初筛庆大霉素高产菌株和复筛获得高产菌株保藏：将快速筛选得到的菌株转接至深孔板斜面培养基上长出的对应的高产菌株同时接种于大试管斜面或茄子瓶斜面并进行摇瓶发酵培养，发酵摇瓶培养结束后执行液相检测方法确定组分是否符合药典要求，如确认高产菌株则进行20-30％甘油管保藏菌种；

第五步，高产菌株稳定性考察：大试管斜面或茄子瓶斜面连续传代五次并进行发酵摇瓶培养测定庆大霉素产量和组分，确定经过初筛和复筛而获得高产菌的遗传稳定性。

在本发明的一个实施方式中，培养用的深孔板或微孔板斜面为24孔板或48孔板，培养温度35±0.5℃，湿度40％～65％，培养时间8-10天。