[发明专利]一种从体外培养的细胞中提取细胞液的方法

说明书

本发明公开了一种从体外培养的细胞中提取细胞液的方法，本发明提供的从体外培养的细胞中提取细胞液的方法，通过将器官组织中的细胞进行体外培养，细胞成分均一，没有其它成分影响细胞质的提取，在进行细胞质的提取时，可保持细胞质中各种细胞因子及活性蛋白的生物活性不损失。

技术领域

本发明涉及一种细胞液制备工艺，具体是一种从体外培养的细胞中提取细胞液的方法。

背景技术

动物器官在用于生产时会遇到各种各样的问题，组织块中成分复杂，例如有脂肪、胶原蛋白等难溶物质的存在，难以进行过滤除菌，同时细胞间质多，又有各种各样的细胞，均质后即使经过多次离心，仍然浑浊，难以做进一步纯化提取，且脂肪含量高，杂质多，难分离。

现有技术中通常为了简化生产过程，大多采用酶解的方式获得蛋白水解物，蛋白被降解，失去原本的生物活性，只能做为营养物质，基于此，我们提出一种从体外培养的细胞中提取细胞液的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从体外培养的细胞中提取细胞液的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种从体外培养的细胞中提取细胞液的方法，包括以下步骤：

1）在无菌环境下将去除血管和包膜组织的新鲜动物器官用手术剪将剩余组织剪碎；

2）将剪碎的组织块放入离心管中，用两倍体积的37℃预温的磷酸盐缓冲液（PBS）+0.25% 胰蛋白酶进行消化2min，液体浑浊时将组织消化液吸出转入另一离心管，加入2%的血清和胰蛋白酶中；未消化完成的组织块继续加入胰蛋白酶消化液进行消化，直至组织块全部消化成组织消化液；

3）组织消化液经细胞筛过滤去除大块细胞团，然后进行一次离心处理；

4）收集的细胞用RPM1640+10% 金源康胎牛血清（FBS）重悬、计数，转入细胞瓶培养；

5）选取可以传代的细胞进行扩大培养，达到一定数量后用胰蛋白酶消化、收集细胞，开始细胞质提取操作；

6）细胞消化后用磷酸盐缓冲液（PBS）重悬、计数，洗涤一至二次；

7）取准备好的磷酸盐缓冲液（PBS）+20%甘油，按照1~5 *107cells/ml的浓度对细胞进行重悬，并放入冰箱快速冷冻，1h后取出融化，重复三次后，进行二次处理，取上清，得细胞精华，即为细胞提取液。

作为本发明进一步的方案：步骤3）中，所述一次离心处理的转速为1000-2000r/min。

作为本发明再进一步的方案：步骤3）中，所述一次离心处理的时间为2-8min。

作为本发明再进一步的方案：步骤7）中，所述二次离心处理的转速为3000-5000r/min。

作为本发明再进一步的方案：步骤7）中，所述二次离心处理的时间为2-8min。

作为本发明再进一步的方案：步骤7）中，所述冷冻温度为-75℃~-85℃。

作为本发明再进一步的方案：步骤7）中，所述二次处理的方式为离心处理。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供的从体外培养的细胞中提取细胞液的方法，通过将器官组织中的细胞进行体外培养，细胞成分均一，没有其它成分影响细胞质的提取，在进行细胞质的提取时，可保持细胞质中各种细胞因子及活性蛋白的生物活性不损失。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

实施例1