[发明专利]一种人细小病毒和人博卡病毒双重实时荧光PCR检测引物、探针、试剂盒及检测方法

说明书

本发明属于生物技术应用领域，具体涉及一种人细小病毒和人博卡病毒双重实时荧光PCR检测引物、探针、试剂盒及检测方法，达到定量检测、灵敏度高、特异性高以及预防假阴性的效果，为临床样本中人细小病毒B19V和人博卡病毒的快速定量检测提供了完备的解决方案，能实现对人细小病毒B19V和人博卡病毒快速、准确的定量检测。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人细小病毒和人博卡病毒双重实时荧光PCR检测引物、探针、试剂盒及检测方法。

背景技术

目前我国儿童中主要存在人细小病毒B19V及人博卡病毒HBoV感染，两者均可通过呼吸道传播且均为细小病毒中的一种。细小病毒是直径约22nm的无包膜二十面体病毒，包含线性单链DNA基因组。细小病毒科(Parvoviridae)是已知的感染哺乳动物细胞的最小DNA病毒之一，被分为两个亚科，细小病毒亚科(Parvovirinae)和浓核病毒亚科(Densovirinae)，分别感染脊椎和无脊椎动物细胞。目前根据脊椎动物病毒细小病毒亚科的开放读码框数量、转录定位、自主或在辅助病毒帮助下复制、序列同源性等因素分为原细小病毒(Protoparvovirus)、依赖性细小病毒(Erythoparvovirus)、博卡细小病毒(Bocaparvovirus)、埃文细小病毒(Aveparvovirus)、Copi细小病毒(Copiparvovirus)、细小病毒四(Tetraparvovirus)、阿留申病毒(Amdovirus)。

人细小病毒B19V细小病毒亚科红系细小病毒属，人群感染率达60％～70％以上。不同年龄和免疫状态的人群感染B19V后的临床表现不同。B19V是儿科常见的出疹性疾病——传染性红斑(又称第五病，Erythema infection，EI)的病因；免疫力正常人群感染后一般为轻型自限性症状；孕妇感染可造成胎儿水肿和先天性贫血，严重时导致胎儿死亡；先天免疫缺陷患者、艾滋病患者、肿瘤或器官移植手术后进行化疗的患者感染会导致慢性贫血症；镰状细胞贫血症等血液系统疾病患者感染会发生再生障碍性危象而导致急性贫血。此外，某些肾病、肝炎、神经性疾病、心肌损伤和一些自身免疫疾病等病例也可能与B19V的感染有关。B19V可以被分为1、2、3三种基因型，其中1型和3型又各自分为两种亚型。不同基因型毒株的地理分布不同：B19V1型在全球范围占主导地位，B19V2型仅在丹麦、芬兰和欧洲西北部等国家被发现，B19V病毒3型在法国、美国、巴西、加纳、欧洲等地均有报道。

人博卡病毒(humanbocavirus，HBoV)发现于2005年，属于细小病毒亚科的博卡病毒属。当时确定为儿童下呼吸道感染病因而作为“病毒探索计划”中的一部分，这种呼吸道病毒现在被分类为1型HBoV，随后在粪便样本中检测到相关病毒：2型～4型HBoV。1型HBoV主要在呼吸道分泌物中发现，虽然在每个季节都可检测到，但与其他呼吸道感染类似，原发感染主要发生于冬春两季的月份。以1型HBoV为抗原的血清学研究发现，绝大部分人在6岁以前被感染过。1型HBoV主要经呼吸道传播，与呼吸道感染(特别是哮喘)相关。NS1基因相对较保守。HBoV与其它呼吸道病毒有较高的合并感染，HBoV单独感染与合并其它呼吸道病毒感染在临床特征方面无明显差别。HBoV与牛细小病毒和犬极小病毒同属细小病毒亚科中的博卡病毒属，可引起儿童急性呼吸道感染。

《细小病毒B19与人博卡病毒的基因检测及基因特异性探针的初步研究》(张学红，第四军医大学硕士学位论文，2009年5月)中公开了一种检测B19和HBoV的基因芯片技术，是一种快速、敏感、高通量、高效的临床诊断方法。由于芯片制作的工艺复杂,信号检测也需要专门的仪器设备，一般实验室难以承担其高昂的费用；需采用来自大小相近的多个基因芯片片段作为探针来检测同一分子以显著提高信噪比，增加杂交动力学范围,显著降低假阳性率；可以特异性的检测出不同的细小病毒变种，但对B19样本的呼吸道标本中病毒的检出率较低，HBoV混合感染其他病毒的样本中也未检出HBoV。