[发明专利]一种干细胞外泌体补片及其制备方法

权利要求书

1.一种干细胞外泌体补片，包括补片基材，其特征在于：所述补片基材的上部设有隔离层，所述隔离层的上部设有干细胞的外泌体，所述干细胞的外泌体为干细胞分泌的分子直径为30-100nm的亚细胞双层囊膜泡。

2.一种干细胞外泌体补片的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1：制备电纺液：将聚(左旋乳酸-己内酯)和聚氨酯加入有机溶剂中，其中聚(左旋乳酸-己内酯)、聚氨酯和有机溶剂的质量比为6:2:92，搅拌溶解1-3天，烧杯口用保鲜膜封闭，放置于恒温多磁头搅拌器搅拌溶解，搅拌速度200-2000rpm，搅拌1-3天后得到电纺液；

S2：液体纺丝：将步骤S1制取的电纺液在高压静电动态纺纱装置中进行静电纺丝，所述高压静电动态纺纱装置包括：溶液储存装置、喷射装置、水浴装置和接收卷轴，静电纺丝的温度37-42℃，静电纺丝电压1-3kv，喷射装置输送溶液速度0.5-3ml/h，喷射装置中所需针头型号为8号，针头与水浴装置的距离为10-20cm，水浴装置中水的深度为5-40cm，水浴装置底部孔径为0.1-1.5cm,水浴装置与接收卷轴之间的距离5-20cm，即得到补片基材；

S3：喷涂隔离层：将步骤S3中制取的补片基材从接收卷轴上取下，在补片基材上侧和下侧喷涂隔离层，所述隔离层为聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯和乙烯聚四氟乙烯中的一种或几种，即得到喷涂隔离层后的补片基材；

S4：补片基材后处理：将步骤S3中取得的补片基材，放置于-80℃冰箱2-12小时，取出后放入冷冻干燥机约24-48小时，温度为-(20-80)℃，压力为0.6-1.0MPa，冷冻干燥后的补片裁剪成长10cm、宽10cm；

S5：制取过滤外泌体：无菌条件下收集纯化的干细胞的培养上清液10mL，在4℃下以300r/min离心10分钟后，吸取上清液至另一干净无菌的15mL离心管中，在4℃下以2000r/min离心20分钟，吸取上清液至另一干净无菌的15mL离心管中，在超净工作台中，将收集得到的液体用0.22μm滤膜过滤，收集滤后液体，在4℃下以1000r/min离心70分钟，得到白色沉淀即为外泌体，吸去上清液，加无菌PBS磷酸缓冲液洗涤，在4℃下以1000r/min离心60分钟，用1mL无菌PBS重悬外泌体，再用100nm超滤离心管于4℃下以300r/min离心30分钟过滤，之后用0.22μm超滤离心管于4℃下以300r/min离心30分钟过滤外泌体备用；

S6：补片基材消毒：将步骤S4中取得的补片基材用无菌生理盐水擦洗10次，置于无菌方盘中，使用含抗生素的碳酸盐缓冲液浸泡2次，每次5分钟，将补片基材置入无菌纯水中，在37℃水浴中浸泡30分钟，浸泡后置入10mL含0.3％(w/v)十二烷基硫酸钠的无菌PBS盐溶液(0.01mol/L、pH＝6～8)中，在37℃水浴中震荡处理，震荡转速为185rpm，震荡10～12小时，后置入50ml含抗生素的碳酸盐缓冲液中，在25℃水浴中震荡冲洗6次，每次60分钟，得到洗净后的补片基材，用钴60照射灭菌后，4℃下保存备用；

S7：制得干细胞外泌体补片：将步骤S6中消毒过的补片基材取出，并滴加步骤S5中制取的过滤外泌体，放入37℃培养箱中静置5-10min使其凝固，即可获得干细胞外泌体补片。

3.根据权利要求2所述的干细胞外泌体补片的制备方法，其特征在于：所述有机溶剂为六氟异丙醇溶剂。

4.根据权利要求2所述的干细胞外泌体补片的制备方法，其特征在于：所述干细胞为心脏干细胞、皮肤干细胞、血管内皮祖细胞、神经干细胞、造血干细胞、胚胎干细胞、诱导性多潜能分化细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞、羊膜干细胞、角膜缘干细胞、成体干细胞和经血干细胞中的一种或几种。

5.根据权利要求2所述的干细胞外泌体补片的制备方法，其特征在于：所述抗生素为100U/mL青霉素G和100μg/mL硫酸链霉素。

6.根据权利要求2所述的干细胞外泌体补片的制备方法，其特征在于：所述碳酸盐缓冲液的浓度为0.05mol/L，pH为9.0～9.6。