[发明专利]基于多维指标针对长期堆煤对土壤细菌影响操作方法

权利要求书

1.基于多维指标针对长期堆煤对土壤细菌影响操作方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：研究区域选择及土壤样品采集；

从多个发电厂采集土壤样品，每个发电厂采集的样品分别进行DNA提取和测量土壤理化性质；

步骤二：土壤理化性质分析；

采用水土悬浮液，测量其pH值、土壤有机质、总氮、总磷、总钾含量，之后提取土壤溶解有机物质，随后将悬浮液离心，离心后获取其上清液，并通过无菌膜过滤，确定提取的土壤DOM的官能团，记录土壤DOM的三维激发-发射矩阵荧光光谱；

步骤三：DNA提取、PCR扩增和IlluminaMiSeq测序；

在步骤一种所采集的土壤中提取DNA，选择扩增16S rRNA基因V4区的引物组

515F(5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3')和

806R(5'-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3')扩增原核生物的细菌和古细菌，引物组Euk1391F(5'-GTACACACCGCCCGTC-3')和EukBR(5'-TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3')扩增18S rRNA基因以扩增真核谱系，对扩增进行测序；

使用土壤微生物DNA强力提取试剂盒从上述采集的土壤中提取DNA，选择扩增16S rRNA基因V4区的引物组

515F(5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3')和

806R(5'-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3')扩增原核生物的细菌和古细菌，引物组Euk1391F(5'-GTACACACCGCCCGTC-3')和EukBR(5'-TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3')扩增18S rRNA基因以扩增真核谱系，再用荧光计定量后，在二代高通量测序平台上对扩增进行测序；

步骤四：16S和18S测序数据的处理；

测序获得的序列进行处理和分析，将低质量序列舍去，再将剩余的序列进行分类，并进一步分析；

步骤五：长期堆煤对土壤性质和微生物群落影响分析；

对草坪的测试对照组和煤场土之间的土壤性质进行比较，研究长期堆煤对土壤PH、总氮、总钾、总磷的影响。

2.根据权利要求1所述的基于多维指标针对长期堆煤对土壤细菌影响操作方法，其特征在于，在步骤一中，从多个发电厂采集土壤样品，每个发电厂包含两个采样点，其中一个在煤场采集，另一个在草坪土壤中采集作为对照组，从每个采样点的煤层和草坪层下面的土壤岩心采用立体网状采样法收集土壤样品，将新鲜土壤样品过筛，除去可见的根和其他残留物，将样品中的每一个分成两个子样品，其中一个用于DNA提取，另一个用于测量土壤理化性质。

3.根据权利要求2所述的基于多维指标针对长期堆煤对土壤细菌影响操作方法，其特征在于，在步骤二中，采用水土悬浮液，并进行摇动均匀，使用pH计测量土壤pH值，用重铬酸钾法测定土壤有机质，通过元素分析仪测量总氮含量，通过HF-HClO₄消解有机物和还原性物质，然后分别使用钼蓝分光光度法和火焰光度法测定土壤中总磷和总钾的含量；

摇动悬浮液，提取土壤溶解有机物质，随后将悬浮液离心，离心后获取其上清液，并通过无菌膜过滤；

应用三维激发-发射矩阵荧光光谱确定提取的土壤DOM的官能团，用氙弧灯作为激发源的荧光分光光度计记录土壤DOM的三维激发-发射矩阵荧光光谱；

应用500～900V的PMT电压和自动响应时间，使用2～8nm激发和发射狭缝记录光谱，波长设定为200～400nm用于激发，并且220～550nm用于发射。