[发明专利]一种外泌体的制备方法

权利要求书

1.一种外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、脐带间充质干细胞上清液的制备，将不含外泌体血清的培养基加入到脐带间充质干细胞中，将其稀释成细胞悬液接种于细胞培养瓶中培养，收取培养后的上清液；

S2、脐带间充质干细胞外泌体的分离存化，将步骤S1中得到的上清液进行处理，首先，将上清液中的细胞杂质、死细胞过滤，使用无菌滤膜过滤，并将所得的外泌体沉淀分装于无菌离心管中，保存备用，然后将其稀释成细胞悬液接种于25cm³的细胞培养瓶中，置于45℃、6％CO₂、湿度饱和的培养箱中培养40-80h时收取细胞培养后的上清液，收集达到250ml以上，进行外泌体的提取；

S3、外泌体的提取，首先，将步骤S2中得到的液体进行离心，将上清液离心处理，转移上清液，去除其中的死细胞，然后在通过0.22μm的无菌滤膜过滤，去除其中的杂质，其次，在将得到的上清液超速离心沉淀外泌体，去除上清液后加入500μlPBS溶解收集外泌体沉淀，最后再使用0.22μm的无菌滤膜过滤，得到浓缩的外泌体浓缩液中加入乳酸钠、氯化钠和氯化钾进行溶解，得到外泌体盐溶液，在将外泌体提取液加入到外泌体盐溶液中培养，将培养后的溶液在4℃12000g、超速离心70min沉淀外泌体，并将所得外泌体沉淀分装于无菌离心管中，-80℃保存备用。

2.根据权利要求1所述的一种外泌体的制备方法，其特征在于：在步骤S2中，当样品浓度过大时，通过加入等体积的PBS缓冲液进行稀释。

3.根据权利要求1所述的一种外泌体的制备方法，其特征在于：在步骤S1中，将不含外泌体血清的培养基加入到脐带间充质干细胞中，培养24-48h，细胞融合度达到80％-95％左右时收取上清。

4.根据权利要求1所述的一种外泌体的制备方法，其特征在于：在步骤S3中，首先，上清液于4℃2000g、,离心10min去除死细胞，然后在于4℃10000g、超速离心60min沉淀外泌体。

5.根据权利要求1所述的一种外泌体的制备方法，其特征在于：在步骤S3中，过滤去除囊泡所用的滤网的孔径为0.20μm～0.24μm，还可以选择0.22μm。

6.根据权利要求1所述的一种外泌体的制备方法，其特征在于：在步骤S3中，低温离心为2℃～6℃下以1800g～2200g进行离心。