[发明专利]一种用于凋亡信号通路原位成像的一体式DNA纳米元件及其制备方法

说明书

本发明公开了一种用于细胞凋亡信号通路有效成像的DNA纳米器件的设计原理、最优条件及其成像应用。虽然许多细胞凋亡信号通路已由经典的分子生物学技术所揭示，但细胞凋亡相关研究仍然迫切需要研发具有可操作性和高效率的技术和方法。为此，我们设计了一种DNA纳米器件，它是通过在金纳米颗粒表面组装一层Y型DNA结构所构建而成。只有包含了上游的锰超氧化物歧化酶信使RNA和下游的细胞色素c的凋亡信号通路作为输入时，DNA纳米器件才能执行“与”逻辑门操作，使Y型DNA从金纳米颗粒表面去组装，输出荧光信号。与靶向单个信号分子的分析方法相比，本发明中的DNA纳米器件同时表征上下游两个相关的信号分子，可以实现对细胞凋亡的信号通路直接的原位分析。

技术领域

本发明属于生物分析化学领域，尤其涉及一种一体式纳米元件，用于对凋亡信号通路进行有效成像的构建及应用，该纳米元件是通过在金纳米粒子 (AuNP)上组装精心设计的Y形DNA(Y-DNA)层而构建的。只有当涉及锰超氧化物歧化酶(MnSOD)mRNA和下游cyt c的凋亡信号通路作为输入时，纳米器件才能执行“和”逻辑门操作，从纳米颗粒中分解Y-DNA，然后输出荧光信号。

发明背景

细胞凋亡是细胞死亡的三种典型形式之一，是一种保守的、不可逆的程序性细胞死亡，在生物体内受到严格的调控。细胞凋亡调控的放松与多种人类疾病密切相关，如细胞凋亡相关的神经退行性疾病和移植排斥、细胞凋亡相关的自身免疫性疾病、癌症和某些病毒感染。因此，阐明细胞凋亡的激活机制和监测细胞凋亡的进展对于细胞生物学和人类疾病的预防都是必不可少的。

细胞凋亡的激活参与了由线粒体途径、死亡受体途径和内质网应激途径组成的相互交织的网络中。每个激活途径都由各种凋亡分子介导的信号途径组成，如线粒体途径中的细胞色素c(Cyt c)依赖的信号途径作为死亡受体通路中配体介导的信号通路。通过一些经典的分子生物学技术已经很好地揭示了这些通路。然而，在细胞凋亡相关疾病的诊断和治疗中，开发具有相当的可操作性和成本效益的技术是非常必要的。此外，在信号网络中发现了具有协同作用或拮抗作用的不同信号通路之间的相互作用，迫切需要从复杂的相互作用信号通路中准确识别出一种特定的信号通路，这对机制研究和药物发现也具有重要意义。然而，传统的方法通常是分别针对两个或两个以上的相关分子来定义信号通路。模拟物、活化剂或抑制剂也需要关联目标分子，使该程序适合机制研究，但费力且不利于实际应用，包括准确识别感兴趣的信号通路。

解决上述问题的一种可能方法是逻辑分析信号通路中的几个相关靶分子，并最终输出能够反映该通路的单个信号。因此，由于原位分析能够避免复杂的分离和提取步骤，并能在单细胞水平上提供信号通路的动态信息，因此是首选的分析方法。最近，许多方法和探针已经被开发出来用于原位分析，但通常仅限于针对单个分子，这不能用于信号通路的分析。鉴于此，我们提出了一种策略，通过逻辑分析揭示信号通路而不是单个信号分子。分析一个上游的mRNA 和一个下游的信号蛋白，它们之间的联系描述了一个最简单的正调节信号通路。在我们的策略中，一个设计良好的一体式DNA纳米元件被制造出来。只有当上游mRNA和下游蛋白共存时，纳米元件才执行“和”逻辑门操作，并最终输出荧光信号。由于该分析系统集成度高、易访问、可用于活细胞，作为药物发现的细胞分析模型、凋亡过程的动态监测等具有广阔的应用前景。

发明内容