[发明专利]功能性肝细胞诱导方法及其专用三维诱导培养基和应用

权利要求书

1.一种适用于由肝脏类器官向肝细胞分化的功能性肝细胞三维诱导培养基，其特征在于，包括第一阶段三维培养基和第二阶段三维培养基；其中：

所述第一阶段三维培养基以HCM培养基/HM培养基为基础培养基，还包含0.01％-1％BSA、0.2％-10％B-27、浓度为0.1-10mM的抗氧化剂N-乙酰基-L-半胱氨酸、浓度为0.05-2mM的L-抗坏血酸盐、浓度为5-20μM的ROCK信号通路抑制剂Y-27632、浓度为5-50ng/mL的肝细胞细胞生长因子HGF、浓度为5-50ng/mL的抑瘤素M OSM、浓度为0.1-1mM的地塞米松Dex、浓度为10-1000U/mL的青霉素和浓度为0.01-1mg/mL的链霉素；

所述第二阶段三维培养基由以下成分组成：作为基础培养基的HCM培养基/HM培养基、0.01％-1％BSA、0.2％-10％B-27、浓度为0.1-10mM的N-乙酰基-L-半胱氨酸、浓度为0.05-2mM的L-抗坏血酸盐、浓度为5-20μM的ROCK信号通路抑制剂Y-27632、浓度为5-50ng/mL的表皮细胞生长因子EGF、浓度为0.1-1mM的地塞米松Dex、浓度为0.5％-10％的胰岛素-转铁蛋白-硒钠ITS、浓度为50-200μM的腺苷酸环化酶激动剂8-Br-cAMP、浓度为5-20μM的维生素K2、浓度为5-20μM的石胆酸、浓度为10-1000U/mL的青霉素和浓度为0.01-1mg/mL的链霉素。

2.根据权利要求1所述的功能性肝细胞三维诱导培养基，其特征在于，所述第一阶段三维培养基中，所述抗氧化剂N-乙酰基-L-半胱氨酸的浓度为1.25mM；所述L-抗坏血酸盐的浓度为0.2mM；所述ROCK信号通路抑制剂Y-27632的浓度为10μM；所述肝细胞细胞生长因子HGF的浓度为20ng/mL；所述抑瘤素M OSM的浓度为20ng/mL；所述地塞米松Dex的浓度为0.5μM；所述青霉素的浓度为100U/mL；所述链霉素的浓度为0.1mg/mL；

所述第二阶段三维培养基中，所述抗氧化剂N-乙酰基-L-半胱氨酸的浓度为1.25mM；所述L-抗坏血酸盐的浓度为0.2mM；所述ROCK信号通路抑制剂Y-27632的浓度为10μM；所述胰岛素-转铁蛋白-硒钠ITS的浓度为1％；所述表皮细胞生长因子EGF的浓度为10ng/mL；所述地塞米松Dex的浓度为0.5μM；所述腺苷酸环化酶激动剂8-Br-cAMP的浓度为100μM；所述维生素K2的浓度为10μM；所述石胆酸的浓度为10μM；所述地塞米松Dex的浓度为0.5μM；所述青霉素的浓度为100U/mL；所述链霉素的浓度为0.1mg/mL。

3.根据权利要求1或2所述的功能性肝细胞诱导三维培养基，其特征在于，所述第一阶段三维培养基的配方为：

以HCM/HM培养基为基础培养基，还包含1％B-27、0.1％BSA、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、0.2mM L-抗坏血酸盐、10μM Y-27632、20ng/mL HGF、20ng/mL OSM、0.5μM Dex、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素。

4.根据权利要求1或2所述的功能性肝细胞三维诱导培养基，其特征在于，所述第二阶段三维培养基由以下成分组成：

作为基础培养基的HCM/HM培养基、1％B-27、0.1％BSA、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、10μM Y-27632、1％ITS、10ng/mL EGF、0.2mM L-抗坏血酸盐、0.5μM Dex、100μM 8-Br-cAMP、10μM vitamin K2、10μM Lithocholic acid、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素。

5.一种功能性肝细胞诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：将多能性干细胞定向诱导分化为肝干/祖阶段细胞；其中所述多能性干细胞不包括直接分解自人胚胎或胚泡的人多能干细胞或胚胎干细胞；

S2：将步骤S1获得的肝干/祖阶段细胞使用三维扩增培养基进行三维扩增培养，获得肝脏类器官；

S3：将S2获得的肝脏类器官消化成单个细胞后使用权利要求1-4中任一项所述的功能性肝细胞三维诱导培养基向功能性肝细胞进行诱导分化。