[发明专利]一种基于CRISPR技术定向遗传改造米曲霉基因的方法

说明书

本发明提供了利用一种可以在Aspergillus属真菌内进行自主复制的穿梭载体，并通过组成型启动子PgpdA启动表达cas9，定向遗传改造米曲霉基因的方法，该方法消除了载体插入位点和培养基组分对cas9表达的影响，提高了基因编辑效率，并且能够产生无标记(Marker‑Free)的米曲霉工程菌，免除对转基因的担忧，提高转基因改造米曲霉的实用性。

技术领域

本发明涉及生物技术的基因工程领域，具体涉及利用CRISPR技术定向遗传改造米曲霉基因的方法。

背景技术

米曲霉用于酱油、米酒等食品发酵已有悠久的历史，因此被认为是国际公认的食品安全级的真菌。2005年米曲霉基因组测序工作的完成，为加快遗传改造米曲霉，使其成为高效生产酶制剂、真菌代谢产物的理想菌株奠定了基础。但由于米曲霉多核，表型多变，对常用筛选标记药物不敏感，导致遗传改造米曲霉进展缓慢，工业生产应用受限。

当前米曲霉遗传操作的成功与否依赖于两个因素：第一个是筛选标记的选择；第二个是同源同组的效率问题。由于米曲霉对多种抗性药物不敏感，使得米曲霉遗传转化筛选主要依赖于营养缺陷型菌株的构建，而营养缺陷型菌株的构建费时，工作量大，其效率取决于同源重组的效率。目前研究表明，敲除参与非同源重组途径的基因能够促进同源重组效率，这些基因主要有ku70，ku80，LigD。因此，为了提高米曲霉遗传操作，常常需要构建ku70，ku80，LigD和营养双缺陷菌株。而且，对于工业应用中常需要转化多个基因，这样就需要构建包含多个营养缺陷的菌株，这无疑加大了遗传改造米曲霉的难度。此外，多个营养缺陷筛选标记的构建势必造成宿主菌株表型和代谢的改变，这对于后续利用该遗传改造的菌株造成影响。

利用CRISPR-Cas系统在真菌中进行基因编辑，能够很好的解决上述问题。首先CRISPR-Cas系统敲除基因的效率不依赖于同源同组，这样免去了敲除ku70，ku80，LigD的繁琐；其二，CRISPR-Cas系统可利用一个营养缺陷筛选标记完成对多个基因的遗传改造。这些恰好解决了上述传统的同源重组改造米曲霉的困难。但CRISPR-Cas系统也有一些弊端。例如CRISPR-Cas表达盒若插入到异染色质上，引起Cas9表达量低，造成基因编辑效率低；在米曲霉中常利用α淀粉酶诱导型启动子amyB启动表达Cas9，该启动子受培养基中碳源类型诱导表达，而碳源类型对米曲霉的生长影响大，从而影响后续转基因表型鉴定；无法形成无标记(Marker-Free)的工程菌株，引起人们对转基因的担忧。为了解决上述CRISPR-Cas系统的问题，本发明通过利用一种可以在Aspergillus属真菌内进行自主复制的穿梭载体，并通过组成型启动子PgpdA启动表达cas9，使cas9的表达不受插入位点及培养基组分影响，提高基因编辑效率，并能够形成Marker-Free工程菌株。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何高效的遗传改造米曲霉基因。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种基于CRISPR技术定向突变米曲霉基因的方法。

本发明所提供的基于CRISPR技术定向突变米曲霉基因的方法中，所包括的步骤如下：

1)以cas9序列(Katayama等人(2016)Biotechnol Lett 38:637–642)为参考，人工合成cas9基因，其核苷酸序列为序列1所示的DNA分子；以上述人工合成的cas9基因为模板，以序列SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2的DNA片段为引物，执行PCR扩增获得的cas9 DNA分子重组连接到载体pEX1上(该载体出自于Nguyen等人(2016)World J Microbiol Biotechnol，32:204)。所述重组载体为将pEX1的XhoI和BamHI识别序列间的DNA替换为序列1所示的DNA分子得到的重组载体pEX1-cas9。pEX1-cas9重组载体含有由构巢曲霉基因gpdA基因启动子PgpdA，序列1所示的cas9基因，trpC基因终止子(TtrpC)三部分组成的序列2所示的cas9蛋白表达盒，即PgpdA-cas9-TtrpC。