[发明专利]地衣芽孢杆菌LCCC10161在生产α-淀粉酶和烟叶发酵中的应用

权利要求书

1.地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LCCC10161在生产α-淀粉酶中的应用。

2.利用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LCCC10161生产α-淀粉酶的方法，其特征在于，该方法包括将活化的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LCCC10161接种于液体培养基中进行发酵培养，发酵液离心得上清液的步骤。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LCCC10161的接种量为10⁵～10⁷cfu/ml，所述培养为振荡培养，转速为150～250r/min，温度为20～45℃，时间为3～5d；

优选的，接种量为10⁶cfu/ml，转速为200r/min，温度为36℃，时间为4d；

优选的，所述液体培养基含有：豆饼粉0.8g、玉米粉2.0g、NaCl 1.0g、K₂HPO₄ 0.01g、KH₂PO₄ 0.01g、CaCl₂ 0.3g、蒸馏水100mL，pH为7.5～8.5，液体培养基的装量为8～15％；

优选的，pH为8.0，液体培养基的装量为10％；

优选的，将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LCCC10161活化培养15～25d后进行接种；

优选的，活化地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LCCC10161所用培养基为LB培养基；

优选的，LB培养基含有蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L；

优选的，所述离心的温度为0～4℃，转速为8000～12000rpm，时间为20～40min。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在上清液中加入硫酸铵进行沉淀，透析脱盐后，得粗酶液的步骤。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，硫酸铵的饱和度为40～60％；

优选的，在上清液加入硫酸铵溶解后，离心，沉淀用ddH₂O溶解后，使用15～25mmol/L、pH5.8～6.2的醋酸缓冲液透析脱盐。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将粗酶液依次使用DEAESepharose Fast Flow阴离子交换层析柱和Sephadex G-75凝胶过滤层析柱进行纯化的步骤。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述纯化的具体步骤为：

(1)将粗酶液上样到DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱，使用醋酸缓冲液A洗脱至A₂₈₀不变后，再用含0.1mol/L NaCl的醋酸缓冲液进行洗脱，流速为0.8～1.2mL/min，得到收集液；

(2)将收集液上样到Sephadex G-75凝胶过滤层析柱，用含0.2mol/L NaCl的醋酸缓冲液A进行洗脱，流速为0.2～0.4mL/min，收集的活性组分浓缩至密度为1.1～1.2g/ml。

8.地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LCCC10161或权利要求2～7任一项所述的方法在烟叶发酵中的应用。

9.一种烟叶发酵方法，其特征在于，在烟叶中接种地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)LCCC10161进行发酵。

10.根据权利要求9所述的烟叶发酵方法，其特征在于，地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)LCCC10161的接种量为10⁵～10⁷cfu/g，发酵的温度为20～45℃，湿度为50～70％，时间为5～10d。