[发明专利]一种肠激酶活性的检测方法

说明书

本发明提供了一种检测肠激酶活性的方法，包括如下步骤：1）标准品制备：取已知含量的融合蛋白用Tris‑HCl溶液系列稀释；2）样品准备：将融合蛋白与待测肠激酶样品加入到酶切缓冲液中，进行酶切反应，然后将体系更换为Tris‑HCl溶液，作为待检品；3）样品检测：准备并设置高效液相色谱，取标准品与待检品依次上样；4）数据测定与计算：以各标准品峰面积对各标准品质量拟合标准曲线；将待检品中融合蛋白峰代入标准曲线，计算出待检品中融合蛋白的质量，再计算出待测肠激酶样品的酶比活性。本发明通过测定肠激酶底物减少量的方式来计算待测肠激酶的酶比活性，并创造性地归纳出新的数学式，来计算肠激酶活性，能够精确且快速检测肠激酶活性的方法。

技术领域

本发明涉及药物分析领域，具体涉及一种肠激酶活性的检测方法。

背景技术

由于具有相对较高的特异性和较宽的活性范围，肠激酶是一种理想的用于 处理融合蛋白的工具酶，在重组蛋白的生产中得到广泛使用，在蛋白药物研发中 也起着重要作用。

目前，肠激酶的活性检测方法主要有两种。

一种方法基于其天然底物(胰蛋白酶原)即首先使用肠激酶激活胰蛋白酶 原生成胰蛋白酶，胰蛋白酶再与小分子底物反应并检测其产物的吸光值。

另外一种是基于人工合成的连接了肠激酶识别序列的小分子荧光物质。当 肠激酶从荧光物质上切去识别序列后，体系中有荧光产生，可通过计算一段时间 内荧光强度的增加量得到肠激酶活性。

上述两种方法都有其局限性：

第一种方法操作繁琐，且为防止胰蛋白酶自激活，反应需在偏离肠激酶最 适pH的酸性条件下进行，其结果难以反应样品的真实活性；

第二种方法对仪器要求较高，且部分荧光物质属于危化品，具有较大的危 险性。

综上，现有技术存在多种技术问题，不能精确且快速检测肠激酶活性。

本发明已经解决了上述技术问题，提供了一种精确且快速检测肠激酶活性的 方法。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术存在的上述技术问题，提供一种精确且快速检 测肠激酶活性的方法。

本发明的发明人通过测定肠激酶底物减少量的方式来计算待测肠激酶的酶 比活性，并创造性地归纳出新的数学式，来计算肠激酶活性，提供了一种新的技 术方案，并解决了现有技术存在的技术问题。

本发明的技术方案如下：

一种检测肠激酶活性的方法，包括如下步骤：

1)标准品制备：取已知含量的融合蛋白用Tris-HCl溶液系列稀释；

2)样品准备：将融合蛋白与待测肠激酶样品加入到酶切缓冲液中，进行酶 切反应；然后将体系更换为Tris-HCl溶液，作为待检品；

3)样品检测：准备并设置高效液相色谱，取标准品与待检品依次上样；

4)数据测定与计算：以各标准品峰面积对各标准品质量拟合标准曲线；将 待检品中融合蛋白峰代入标准曲线，计算出待检品中融合蛋白的质量，再计算出 待测肠激酶样品的酶比活性；酶比活性定义为：在25摄氏度下，pH 8.0的缓冲 液中每分钟分解1μmol融合蛋白所需的酶量；计算公式如下：

各参数单位如下：

酶比活性单位为：活性单位每毫克，U/mg

蛋白质量单位为：微克，μg

摩尔质量单位为：微克每微摩尔(等价于克每摩尔)，μg/μmol

反应时间单位为：分钟，min