[发明专利]一种应用于马铃薯上的CRISPR/Cas9载体的构建方法

权利要求书

1.一种应用于马铃薯上的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、CRISPR靶点设计：

根据马铃薯PGA2基因序列号AB839753.1设计sgRNA：GGTGTGAAATCGTGGTGCAATGG；

S2、利用同源重组的原理设计引物oligo：

正向序列：5’-AGTCGAAGTAGTGATTGGGGTGTGAAATCGTGGTGCAA-3’，

反向序列：5’-ATTTCTAGCTCTAAAACCTTGCACCACGATTTCACACC-3’；

S3、引物gRNA的形成：

将合成的引物oligo分别稀释成10μM，按如下比例混合，进行退火反应后形成引物gRNA；

反应条件：95℃，2min；95℃，20s；60℃，40s；72℃，15s；15cycles；72℃，5min；

S4、将gRNA和Cas9蛋白结合形成表达盒，连入载体psgR-Cas9-At中，形成中间载体，然后将中间载体用EcoRI和HindⅢ双酶切，得到酶切产物为Oligo引物二聚体，将PCAMBIA1300载体同样用EcoRI和HindⅢ双酶切，得到酶切线性化载体，并按照如下比例混合，在37℃下连接30min得到编辑载体；

S5、将步骤S4中得到的编辑载体转化到大肠杆菌中；

S6、挑取5个单菌落摇菌并进行测序；

S7、将构建成功的载体转入农杆菌中构建工程菌，通过遗传转化转入马铃薯中。

2.根据权利要求1所述的一种应用于马铃薯上的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中，sgRNA序列为GGTGTGAAATCGTGGTGCAATGG，GGTGTGAAATCGTGGTGCAA为设计用于基因敲除的gRNA靶点，TGG为PAM序列。

3.根据权利要求1所述的一种应用于马铃薯上的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，所述S5的具体步骤为取编辑载体10μL，加入到50μL Top10感受态细胞中，混匀后，热激转化，涂抹在含有卡那霉素的培养基平板上，37℃过夜培养。

4.根据权利要求1所述的一种应用于马铃薯上的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，所述S7的具体步骤如下：

S71、无菌苗的扩繁

茎段繁殖培养基为MS固体培养基；无菌苗扩繁时将无菌苗茎段切成2cm左右插入培养基中；

S72、农杆菌扩繁

将甘油菌在LB固体培养基上划线，28℃培养两天后，挑取单克隆接种到5ml LB液体培养基中，28℃，220rpm恒温震荡培养过夜至OD600约为0.6时，5000rpm离心10min收集菌体，将收集的菌体用MS液体培养基重悬至OD600＝0.4；

S73、农杆菌侵染和共培养

将无菌苗茎段切成2cm左右，置于重悬好的农杆菌菌液中，轻柔摇晃10min，用无菌滤纸吸干茎段表面的菌液，将茎段转移到共培养培养基上黑暗培养2-3天；

S74、芽诱导分化

共培养后，将外植体转移到芽诱导分化培养基上，诱导生芽，每隔两周更换一次培养基；

S75、生根及抗性植株筛选

当抗性芽长到2cm时，切芽并将其转入生根培养基中，待形成完整小植株时，切取部分叶片，使用全式金植物组织直接扩增试剂盒提取基因组DNA，设计特异性引物检测植株；

S76、PCR扩增

将提取的基因组DNA，按如下比例混合，混匀后，PCR产物的大小通过1.0％的琼脂糖凝胶电泳得到；

反应条件：94℃5min；94℃30s；58℃30s；72℃30s；30cycles；72℃5min。

5.根据权利要求1所述的一种应用于马铃薯上的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，

所述的MS培养基包括：4.42g/LMS，3％蔗糖，7g/L琼脂粉，PH＝5.8；

所述的LB培养基包括：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、50mg/L卡那霉素、50mg/L庆大霉素；

所述的共培养培养基包括：MS、1.0mg/L吲哚乙酸、0.2mg/L赤霉素、2.0mg/L玉米素、0.5mg/L细胞分裂素，PH＝5.8；

所述的芽诱导分化培养基包括：MS、1.0mg/L吲哚乙酸、0.2mg/L赤霉素、2.0mg/L玉米素、0.5mg/L细胞分裂素、50mg/L卡那霉素、500mg/L噻孢霉素，PH＝5.8；

所述的生根培养基包括：MS、50mg/L卡那霉素，PH＝5.8。