[发明专利]一种利用人参转录因子提高水稻甾醇含量的方法

说明书

本发明涉及一种用人参转录因子提高水稻甾醇含量的方法，属于植物基因工程技术领域。本发明从富含三萜皂苷的韩国高丽人参中克隆AP2/ERF类转录因子PgERF1，构建含PgERF1基因的植物表达载体，遗传转化水稻获得转基因植株，荧光定量PCR检测水稻甾醇生物合成相关基因的表达，并对转基因水稻种子的甾醇含量进行测定。本发明获得的转基因水稻甾醇的含量显著提高，最高是非转化对照的1.93倍，从而提供了一种有效提高水稻甾醇的方法，对提高水稻的营养保健价值具有重要意义。

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种利用人参转录因子提高水稻甾醇含量的方法。

背景技术

植物甾醇又称植物固醇，是一种广泛存在于植物中的天然活性物质，具有降低胆固醇、抗氧化、预防心血管疾病等多种生理保健功能。植物甾醇在植物油类、坚果种子类、豆类等食物中较为丰富，而在主食稻米中含量相对较低，并且主要富集在稻米加工后的米糠等附产物中。提高稻米中的甾醇含量对于促进人体健康具有重要意义。

植物甾醇是类异戊二烯途径的代谢产物，与三萜类皂苷具有相同的前期代谢途径，该途径需要多个关键酶共同催化完成：首先由甲羟戊酸(Mevalonic acid)生成的异戊烯二磷酸(IPP)在香草二磷酸合成酶(merase; GPS:geranylgeranyl pyrophoGPS)作用下形成香叶二磷酸(GPP)，接着利用法呢二磷酸合成酶(farnesyl diphosphate synthase，FPS)转化成法呢二磷酸(FPP)，然后在鲨烯合成酶(Squalene synthase，SS)的作用下合成鲨烯，再经鲨烯环氧酶(Squalene epoxidase，SE)催化转变为2,3-氧化鲨烯(2，3-oxidosqualene)。最后，2,3-氧化鲨烯经过2,3-氧化鲨烯环化酶(OSCs)的环化作用得到植物甾醇和三萜类骨架。

大量研究表明，单独调节萜类化合物合成途径中的某一个关键酶基因不能足以提高其代谢终产物产量，但是某些特定的转录因子可以通过与该合成途径多个关键酶基因的启动子结合，调控这些基因的表达和转录的起始，进而调控萜类化合物的合成，AP2/ERF转录因子就是其中重要一员。例如长春花 (Catharanthus roseus )AP2/ERF类转录因子ORCA3 可调控参与萜类吲哚生物碱生物合成相关基因的表达；青蒿 (Artemisia apiacea)AaERF1和AaERF2 转录因子可以促进青蒿素前体紫穗槐-4,11-二烯至青蒿酸的合成，从而提高青蒿素的含量；此外，从紫杉(Taxus cuspidata)中分离的AP2/ERF转录因子TcAP2 转录因子可通过调控紫杉醇生物合成途径中关键酶基因的表达而增加紫杉醇的积累。珠子参(Panax japonicas) PjERF1转录因子可显著增强珠子参皂苷合成途径关键酶基因的表达量，进而提高了珠子参皂苷的产量。人参(Panax ginseng)是三萜皂苷含量最高的药用植物，将其AP2/ERF转录因子转入水稻中，促进水稻甾醇合成途径相关基因的表达，可以为提高稻米的甾醇含量提供一条行之有效的途径。目前尚未发现与本发明主题所提及的利用人参AP2/ERF类转录因子提高水稻甾醇含量的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种利用人参转录因子提高水稻甾醇含量的方法。

为了实现上述目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种利用人参转录因子提高水稻甾醇含量的方法，该方法包括如下步骤：

(1)采用基因克隆方法获得人参AP2/ERF类转录因子PgERF1；

(2)将PgERF1基因可操作性地连接于表达调控载体，形成含PgERF1基因的植物表达载体；

(3)将含PgERF1基因的植物表达载体转化进根癌农杆菌，获得用于转化水稻的含PgERF1基因植物表达载体的根癌农杆菌工程菌；