[发明专利]一种与青稞条纹病相关的miRNAs及其挖掘方法

说明书

本发明提供一种与青稞条纹病相关的miRNAs及其挖掘方法，通过从青稞条纹病叶上分离纯化青稞条纹病菌株，构建实验室条纹病病原菌侵染体系，采集发病和未发病的幼叶，进行高通量测序(miRNA‑seq)，构建了青稞miRNA的数据库，通过与miRBase 22、PMRD、mRNA/EST和rRNAetc数据库进行比对，挖掘出与青稞条纹病相关的miRNAs。

技术领域

本发明涉及青稞条纹病，具体为一种与青稞条纹病相关的miRNAs及其挖掘方法。

背景技术

青稞(Hordeum vulgare L.var.nudum)属禾本科大麦属，是大麦(Hordeumvulgare L.)的一个变种，遗传背景与大麦高度相似，因内外颖与颖果相分离，籽粒裸露，所以又被称为裸大麦。青稞是青藏高原最具特色的农作物，生产地位举足轻重。

青稞条纹病是影响青稞生产最严重的一种真菌病害(图1)。目前防止青稞条纹病的主要方法为药物浸种处理。但现有浸种药物如立克秀、粉锈宁、浸种灵等(有效成分分别为：戊唑醇、三唑酮、二硫氰基甲烷)会明显影响青稞发芽率，而且浸种温汤需要在技术指导下配制使用，在以藏族为主的广大青稞种植区难以普遍实现。加上高原地区生态环境脆弱，严控农药化肥，药物防治难以推行(李登辉等，2016)。因此，抗病新品种选育是学界对青稞条纹病防控的普遍共识。

青稞条纹病的病原菌无性态为禾内脐蠕孢[Drechslera graminea(Rabenh.exSchl.)Shoemaker，异名Helminthosporium Rabenh.]，属半知菌亚门真菌；有性态为麦类核腔菌[Pyrenophora graminea(Rabenh.)Ito et Kurib.]，是子囊菌亚门的真菌(Gatti etal,1992；吴宽然等，2013)。

虽然青稞条纹病的病原确认已有多年，但是目前对于条纹病发病过程中病原与寄主之间相互作用的分子机制仍不清楚。学者们通过对具有抗与不抗条纹病大麦的品种进行杂交，并对杂种后代进行QTL(数量性状位点quantitative trait loci)分析，定位出三个与抗病相关的基因(QTL)Rdg1a、Rdg2a和Rdg3，分别位于2HL和7HS染色体上(Arru et al,2002；Arru et al,2003；张宇，2016)。对Rdg1a(Biselli et al,2010)和Rdg2a(Haegi etal,2008；Bulgarelli et al,2010)分别进行功能研究，表明过量表达这两个基因能够显著提高地中海品种大麦对条纹病菌株的抗性。但到目前为止，再未见到类似的大麦条纹病作用机制方面的研究报道(吴宽然等，2013)。可见，通过传统的基因定位的分析方法研究青稞条纹病时可能存在瓶颈，需要从新的角度去探索。

MicroRNA(miRNA)是一类21～24nt的非编码小分子RNA，在植物抵御病虫害过程中miRNA起着重要作用(Sun,2012；Chinen et al,2012；Rawat et al,2015)。然而，目前植物病害相关miRNA的报道主要来自拟南芥，在单子叶和麦谷类作物中研究相对较少。在青稞中目前还没有miRNA的报道，即使在大麦中也仅收录了71个miRNA。因此，与其他作物相比，研究青稞miRNA功能可供借鉴的参考信息较少。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供与青稞条纹病相关的miRNAs及其挖掘方法，挖掘出与青稞条纹病相关的miRNAs，为今后青稞抗条纹病基因的挖掘和抗病新品种的选育奠定理论基础。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种与青稞条纹病相关的miRNAs的挖掘方法，包括如下步骤：

步骤1，采集感染条纹病的青稞叶片；

步骤2，条纹病病原菌侵染体系的构建

步骤2.1，对感染条纹病的青稞叶片进行培养并分离获取青稞条纹病病原菌；