[发明专利]一种CAR嵌合抗原受体序列及应用其的CAR-NK细胞

说明书

本发明提供提供一种CAR嵌合抗原受体序列，包括单链抗体结构、胞外区结构、跨膜区结构和胞内区结构；胞外区结构的蛋白多肽序列选自CD8α蛋白多肽序列的片段；跨膜区结构的蛋白多肽序列选自NKG2D蛋白多肽序列的片段；胞内区结构包括2B4胞内区结构或/和CD3ζ胞内区结构，2B4胞内区结构的蛋白多肽序列选自2B4蛋白多肽序列的片段，CD3ζ胞内区结构的蛋白多肽序列选自CD3ζ蛋白多肽序列的片段。本发明提供的CAR嵌合抗原受体序列可有效地激活免疫功能细胞，且能够使嵌合其的免疫功能细胞高效地识别恶性肿瘤细胞。

技术领域

本发明属于细胞免疫治疗领域，具体地，涉及一种CAR嵌合抗原受体序列及应用其的CAR-NK细胞。

背景技术

恶性肿瘤是危害人类健康的主要重大疾病之一。传统肿瘤治疗方式如手术、放疗、化疗是近几十年来用于肿瘤治疗的主要策略，但是，病人会对药物及放疗治疗产生抗性，致使高频率的肿瘤患者复发。肿瘤细胞治疗，因其靶向性、效果显著、几无副作用等优点而得到了极大关注，逐步成为肿瘤综合治疗中的一个重要手段，被业界称为肿瘤的绿色疗法，也是当前肿瘤治疗基础研究和临床应用的热点与发展方向。

自然杀伤细胞(natural killer cell，NK细胞)发挥杀伤活性不需要预先刺激，在基于细胞治疗的人类恶性肿瘤治疗中具有很大潜力。 NK细胞能够在T, B细胞不存在的情况下自发的裂解肿瘤细胞。NK细胞与细胞毒性T细胞有很多共同特征，包括共同的前体细胞、细胞表面受体分子的重排以及颗粒酶依赖的杀伤机制。然而，NK细胞也具有独特性，因其杀伤不需预先刺激以及杀伤肿瘤细胞没有MHC限制性。这让NK细胞在过继肿瘤细胞免疫治疗中应用广泛，其中，过继细胞免疫治疗指的是将外源改造过的细胞回输给病人用于临床应用。

在体外分离、扩增过的NK细胞可以用于自体或异体治疗。然而，从单个供体血液中白细胞中去除T细胞来得到NK细胞的方法获得NK细胞产量不稳定，而且数目不足以达到回输标准。另外，NK细胞在体外非常难以培养，远远达不到细胞免疫疗法的要求。而且，肿瘤病人NK细胞很多本身已经无法正常发挥正常功能。即使在体外培养，也需要加入很多激活物（如IL-2 , IL-12 , IL -5 , IL-18 等），用来增强NK细胞对肿瘤细胞反应。

虽然，目前有很多方法可以制备NK细胞，但是NK细胞的分化效率低，使得NK细胞药物的价格高昂，杀灭活性难以控制，不利于规模化生产和应用。基于此，NK细胞的体外激活和扩增对NK细胞在肿瘤细胞免疫治疗中的进一步推广应用具有不可忽视的现实意义。

肿瘤嵌合抗原受体（CAR）疗法，指的是一种通过嵌合抗原受体在免疫细胞上治疗肿瘤的新型精准靶向疗法，近几年通过优化改良在临床肿瘤治疗上取得很好的效果，是一种非常有前景的，能够精准、快速、高效，且有可能治愈癌症的新型肿瘤免疫治疗方法。通常，CAR通过基因工程技术，将免疫细胞（T细胞、NK细胞）激活，并装上定位导航装置CAR，将普通的T细胞、NK细胞对应地重组为CAR-T细胞、CAR-NK细胞，CAR-T细胞、CAR-NK细胞能够利用其嵌合的CAR，专门识别体内肿瘤细胞，并通过免疫作用释放大量的多种效应因子，能够高效地杀灭肿瘤细胞，从而达到治疗恶性肿瘤的目的。另外，将定位敲入CAR载体后的免疫细胞移植回原患者身体内，可避开自身免疫系统的攻击难题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种CAR嵌合抗原受体序列及应用其的CAR-NK细胞，以有效激活免疫功能细胞并使免疫功能细胞高效地杀灭肿瘤细胞。

根据本发明的一个方面，提供一种CAR嵌合抗原受体序列，包括单链抗体结构、胞外区结构、跨膜区结构和胞内区结构；胞外区结构的蛋白多肽序列选自CD8α蛋白多肽序列的片段；跨膜区结构的蛋白多肽序列选自NKG2D蛋白多肽序列的片段；胞内区结构包括2B4胞内区结构或/和CD3ζ胞内区结构，2B4胞内区结构的蛋白多肽序列选自2B4蛋白多肽序列的片段，CD3ζ胞内区结构的蛋白多肽序列选自CD3ζ蛋白多肽序列的片段。