[发明专利]一种广藿香内生真菌的分离筛选方法

说明书

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种广藿香内生真菌的分离筛选方法。包括培养基制备步骤，内生真菌的分离与纯化步骤，内生真菌的固体发酵培育及粗提物制备步骤，内生真菌的活性筛选步骤。采用组织块分离法从广藿香植株内分离多种内生真菌菌株，进而用滤纸片法筛选出具有抗青枯菌的内生真菌。以此获得多种类型的对青枯菌具有拮抗作用的菌株，用形态观察进行拮抗菌的菌株鉴定，用盆栽试验测内生真菌对青枯病菌的生物防控效果，为广藿香内生真菌的资源利用和防治青枯病提供理论基础，并为番茄青枯病生物防治中提供了可供参考的新的菌株资源。

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种广藿香内生真菌的分离筛选方法。

技术背景

广藿香(Pogostemon cablin(Blanco)Benth.)为唇形科刺蕊草属植物，以干燥地上部分入药，为广东道地药材，“十大广药”之一。药用植物内生真菌广泛存在于药用植物体内，具有丰富的生物多样性，对寄主植物有着积极的作用，其次生代谢产物有着抗肿瘤、抗氧化、抗菌等活性，在医药、农业等方面有着巨大的应用前景。

经调查发现，番茄种植过程中得青枯病，青枯病病害会在短时间内迅速传播，且后期的控制工作也是非常困难的，造成番茄作物大面积萎蔫死亡甚至绝收，最终导致番茄产量下降，严重损害了种植户的经济效益。从广藿香植株的根、茎、叶分离出的内生真菌，对寄主植物抑制青枯病有着积极的作用。

发明内容

本发明的发明目的在于提供一种广藿香内生真菌的分离筛选方法，采用本发明提供的技术方案为广藿香内生真菌的资源利用和防治青枯病提供了理论基础。

为了达到上述发明目的，本发明提供一种广藿香内生真菌的分离筛选方法，包括以下步骤：

培养基制备步骤，用于制备所述内生真菌分离筛选方法所需的培养基；

内生真菌的分离与纯化步骤，用于从广藿香植株中分离出内生真菌，并纯化得到内生真菌的菌株；

内生真菌的固体发酵培育及粗提物制备步骤，用于通过完成纯化得到的菌株发酵并浓缩得到内生真菌的粗提取物；

内生真菌的活性筛选步骤，用于对内生真菌的粗提取物筛选出具有抗青枯菌的内生真菌。

优选的，在培养基制备步骤中，所述培养基包括：

由马铃薯、葡萄糖和琼脂培养形成的PDA培养基；

由马铃薯、葡萄糖、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、维生素B1和水培养形成的PDB液体培养基；

由蛋白胨、牛肉膏、氯化钠和琼脂培养形成的NA培养基；以及

由蛋白胨、牛肉膏和氯化钠培养形成的NA液体培养基。

优选的，所述内生真菌的分离与纯化步骤包括以下步骤：

A100、采集健康的广藿香植株，清洗并切成小块制成样品；

A200、将样品依次浸泡于乙醇、NaClO溶液和乙醇完成消毒杀菌，再用无菌水冲洗；

A300、将完成冲洗的样品置于PDA培养基中恒温培养；待样品长出菌丝，及时挑出PDA培养基中的单一菌丝至新的PDA培养基中恒温培养,并反复操作A300，直至获得纯化的若干内生真菌菌株。

优选的，内生真菌的固体发酵培育及粗提物制备步骤包括以下步骤：B100、将步骤A300中纯化得到的内生真菌菌株接种到PDA培养基中；

B200、发酵若干天后加入乙酸乙酯浸泡；

B300、将浸泡后的PDA培养基捣碎再次浸泡，依次过滤并减压浓缩得到内生真菌的粗提取物。