[发明专利]一种检测血小板衍生生长因子BB的均相生物分析方法及其应用

说明书

一种检测血小板衍生生长因子BB的均相生物分析方法及其应用，利用两条核酸适配体S1和S2与PDGF‑BB之间的夹心识别反应，得到一种含有Mg²⁺核酸酶的功能核酸结构；再通过引入两个由G‑四链体DNA酶和另外一种Mg²⁺核酸酶的1/2劈开碱基序列组成的发夹结构DNA，以及连接DNA，利用Mg²⁺激活其核酸酶催化剪切作用来实现目标物循环及发夹结构中设计的G‑四链体DNA酶的双重放大释放；利用G‑四链体DNA酶的催化显色反应构建显色产物吸光度与PDGF‑BB分析物浓度之间的定量关系；本发明方法操作简单，成本低廉，灵敏度高，重复性好，对于临床诊断领域蛋白质标记物的方便、自动化检测具有十分重要的应用价值。

技术领域

本发明涉及生物分析技术领域，具体是一种检测血小板衍生生长因子BB的均相生物分析方法及其应用。

背景技术

血小板衍生生长因子（PDGF）是一类由细胞产生的重要促血管生成肽类生长因子和多种细胞的促有丝分裂剂及趋化因子。PDGF家族在胚胎正常发育、细胞生长分化和对机体组织损伤的反应中起着关键作用，肿瘤的发生、发展及动脉粥样硬化等许多病理过程均与PDGF及其受体的异常活性相关。研究表明，PDGF-BB是最早被发现的结缔组织生长因子之一，它的浓度高低与肿瘤的发生、发展关系甚为密切，因此是多种肿瘤治疗及预后处理的靶向生物标志物。

传统方法一般采用基于抗体的酶联免疫吸附法(ELISA)和放射性同位素法等来进行PDGF-BB的检测。由于抗体的成本较高，稳定性较低，而且这些方法一般操作比较复杂，所用仪器较为昂贵，通常还存在分析灵敏度不高或选择性不好的弊端，因而很难满足其在实际样品分析检测领域中的广泛应用。近年来，人们将各种生物信号放大策略与电化学、比色等分析方法相结合，在可用于复杂基质中生长因子方便、灵敏检测的生物分析方法研究方面开展了大量工作。但是，这些方法一般都是基于异相分析模式而构建，往往需要十分繁琐的固相界面修饰，以及多步温育、分离和洗涤操作，甚至还需要结合纳米材料信号放大来提高其分析灵敏度，因而不仅分析时间较长，操作繁琐，而且多步操作还会在一定程度上影响方法的重复性，提高分析成本。因此，在此基础上发展一种操作简单，且具有灵敏度高、准确性好、成本低廉等优良性能的智能型细胞因子生物分析新方法具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的就是针对传统PDGF-BB检测方法操作繁琐、灵敏度较低、分析成本较高、重复性不好等问题，提供一种基于碱基设计及核酸适配体高特异性生物识别作用的PDGF-BB均相生物分析新方法，该方法操作方便，成本低廉，灵敏度高，稳定性好，对操作人员的技术要求低，可简单用于复杂基质中低丰度PDGF-BB分析物的高选择性、高准确度检测，对于实际应用领域中的靶向分析物现场、智能化分析具有很好的应用价值。

为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：

本发明的一种检测血小板衍生生长因子BB（PDGF-BB）的均相生物分析方法，包括以下步骤：

（1）DNA链的高温退火处理

取5个PV管并分别编号为#1、#2、#3、#4和#5，向每个PV管中加入190µL浓度为20mMpH=7.4的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液，所述缓冲溶液中含有100mM NaCl、10mMKCl和10mMMgCl₂；

接着向#1PV管中加入10µL浓度为10µM末端修饰一段Mg²⁺核酸酶1/2劈开碱基系列的PDGF-BB核酸适配体S1，所述核酸适配体S1的碱基序列为5’-CAG GCT ACG GCA CGT AGAGCA TCA CCA TGA TCC TGT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT AGAGTA AGC ACC CAT GTT AGA CCT C-3’；