[发明专利]特异性结合卵巢浆液性腺癌细胞的核酸适配体及其用途

说明书

本发明提供由SEQ ID NO:1所示的特异性结合卵巢浆液性腺癌细胞的单链DNA核酸适配体及其应用。具体地，本发明的核酸适配体及其衍生物相对抗体而言，具有能够化学合成、分子量小、稳定、易于保存和标记等优点。本发明还提供所述单链DNA核酸适配体的应用，它们可以单独地或组合地用于卵巢浆液性腺癌细胞的检测或者卵巢浆液性腺癌病人卵巢组织切片的检测，或者靶向到卵巢浆液性腺癌病人的肿瘤部位。

技术领域

本发明涉及生物和医学领域，特别涉及一种可用于结合卵巢浆液性腺癌细胞的核酸适配体及其筛选方法和用途。

背景技术

卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，其发病率在女性生殖系统肿瘤中占第三位，死亡率居妇科恶性肿瘤之首。主要原因可能是由于其侵袭性强，发现晚，易产生化疗耐药以及临床缺乏有效的靶向药物。卵巢癌主要包括四种组织学类型：上皮性肿瘤，生殖细胞肿瘤，性索-间质肿瘤和转移性肿瘤。上皮性卵巢肿瘤，尤其是卵巢浆液性腺癌是最常见的类型，占卵巢癌发病率的90％。在卵巢癌早期，血清标志物如CA125和人附睾蛋白4(humanepididymis protein4，HE4)常常处于正常范围内，但是肿瘤的中晚期迅速增加。卵巢癌缺乏有效的早期监测手段，NCCN 2018推荐的早期监测和预后评估方法是经阴道超声检查结合血清标志物HE4和CA125。HE4最早在人附睾远端的上皮细胞中发现，对卵巢浆液性腺癌的敏感性为90％，特异性为97％，是鉴别卵巢良恶性肿瘤的一个具有重要价值的肿瘤标志物。HE4蛋白在正常卵巢以及非上皮性卵巢癌病人血清中的表达水平为＜140pmol/L。目前卵巢癌的诊断往往是依据术中快速病理，但是传统的术中冰冻方法是对组织切片进行HE染色，该方法对鉴别卵巢恶性肿瘤的组织学类别具有一定的局限性，而术中冰冻的病理结果对临床手术方式具有决定性的影响；新提出的快速免疫组化，因其价格昂贵，技术不稳定，不能在临床广泛使用，因此寻找卵巢浆液性腺癌更加敏感的标志物，及更加快速简单的术中病理辅助方法，对该疾病的诊断及治疗具有重要意义。

核酸适配体(aptamer)是指通过指数富集的配基系统进化技术(SELEX)筛选分离得到的DNA或者RNA分子，它可以与其它靶标如蛋白质、金属离子、小分子、多肽甚至整个细胞进行高亲和力和特异性的结合，因此在生化分析、环境监测、基础医学、新药合成等方面展示广阔的前景。核酸适配体与抗体相比分子量小，稳定性更好，易改造修饰，无免疫原性，制作周期短，可以通过人工合成等优势，免去了动物免疫、饲养、蛋白提取和纯化等一系列流程。

在卵巢癌的早期检测和靶向治疗中，迫切需要更多敏感和特异性分子探针。特异结合卵巢浆液性腺癌细胞的核酸适配体在检测和靶向治疗上具有重大应用前景。目前已经有一些研究者公布了他们所发现的一些HE4蛋白的核酸适配体序列，然而，这些核酸适配体存在一些缺点，例如，有些核酸适配体的靶标是鼠源的蛋白，实际应用受限；有些核酸适配体分子量大，有些核酸适配体没有动物实验以及细胞和切片实验的验证，是否可应用到检测和治疗上还有待进一步证实。因此，本领域对具有特异性识别卵巢浆液性腺癌细胞的结合亲和力更高的核酸适配体存在需求。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种具有高度特异性、化学性质稳定、易于保存和标记的能够结合卵巢浆液性腺癌细胞的核酸适配体及其衍生物，还相应提供所述核酸适配体的筛选方法和用途。

第一方面，为了解决上述技术问题，使用体外指数富集的配基系统进化(SELEX)技术，筛选得到了特异性结合卵巢浆液性腺癌细胞的核酸适配体。具体的，本发明人设计并合成了一个随机单链DNA文库和相应的引物，用卵巢浆液性腺癌的原代细胞作为正筛细胞，以HOSE细胞和HO8910作为反筛细胞，来筛选具有高度特异性、分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记的能够结合卵巢浆液性腺癌细胞的核酸适配体，由此筛选得到一些特异性结合卵巢浆液性腺癌细胞的核酸适配体，并检测了它们与卵巢浆液性腺癌细胞的结合能力。在此基础上，本发明人完成了本发明。

在第二方面，本发明提供了一种核酸适配体，所述核酸适配体的序列包含或由以下组成：

(1)如下所示的核苷酸序列：